En 1625 devolvió el feudo de Urbino al papa y se retiró a sus posesiones familiares.
Sin embargo, la relación entre los dos cónyuges era cada día peor, y se rompió definitivamente cuando la duquesa descubrió a su esposo en la cama con un paje de la corte.
Pronto se desarrolló una abierta hostilidad entre la nueva gran duquesa y la madre del soberano, que se alineó con Victoria, a quien dio parte en los asuntos del estado, incluyéndola en su Consejo Privado.
Margarita, después de diversos incidentes y sintiéndose postergada, llegó a un acuerdo con su marido, del que se separó en 1675 para volver a Francia, de donde no regresaría jamás, aunque vivió hasta 1721.
Los ducados de Rovere y Montefeltro pasaron a su segundo hijo, el cardenal Francisco María.