Precipitación con etanol
Debido a la alta polaridad del agua, ilustrada por su elevada constante dieléctrica de 80,1 (a 20 °C), las fuerzas electrostáticas entre las partículas cargadas son considerablemente menores en una solución acuosa que en el vacío o en el aire.
Este hecho hace que el agua sea un muy buen disolvente para compuestos cargados como las sales.
El mismo mecanismo opera en el caso de los grupos de fosfato cargados negativamente en la esqueleto del ADN: aunque los iones positivos están presentes en la solución, la fuerza electrostática neta relativamente débil les impide formar enlaces iónicos estables con los fosfatos y precipitarse fuera de la solución.
El etanol es mucho menos polar que el agua, con una constante dieléctrica de 24,3 (a 25 °C).
Si se añade suficiente etanol, la atracción eléctrica entre los grupos fosfato y los iones positivos presentes en la solución se vuelve lo suficientemente fuerte como para formar enlaces iónicos estables y la precipitación del ADN.
Esto suele ocurrir cuando el etanol compone más del 64% de la solución.
Muchos protocolos aconsejan almacenar el ADN a baja temperatura en este punto, pero también se ha observado que puede no mejorar la recuperación del ADN, e incluso puede disminuir la eficacia de la precipitación si se utiliza el tiempo de incubación nocturno.
Para longitudes muy pequeñas y concentraciones bajas se recomienda la incubación nocturna.
En estos casos, el uso de portadores como el ARNt, el glucógeno o la poliacrilamida lineal pueden mejorar mucho la recuperación.
Durante la incubación, el ADN y algunas sales se precipitarán de la solución; en el siguiente paso, este precipitado se recoge por centrifugación en un tubo de microcentrífuga a altas velocidades (~12.000g).
Durante la centrifugación, el ADN precipitado tiene que desplazarse a través de la solución de etanol hasta el fondo del tubo, las temperaturas más bajas aumentan la viscosidad de la solución y los volúmenes más grandes hacen que la distancia sea más larga, por lo que ambos factores disminuyen la eficiencia de este proceso que requiere una centrifugación más larga para el mismo efecto.
[2][3] Tras la centrifugación, se elimina la solución sobrenadante, dejando un pellet de ADN crudo.
Es importante no secar demasiado el pellet, ya que puede provocar la desnaturalización del ADN y dificultar su resuspensión.
Sin embargo, el isopropanol es menos volátil que el etanol y necesita más tiempo para secarse al aire en el último paso.
