Ambos progenitores se habían dado la promesa de matrimonio, pero terminaron su noviazgo sin realizar este compromiso.

La expedición desembarcó en la ciudad de Santa María la Antigua del Darién, donde se encontraban muchos otros destacados futuros conquistadores, entre ellos Francisco Pizarro.

Espinosa decidió realizar una nueva expedición, partiendo en diciembre con 200 hombres, entre los que estaba un ya recuperado Almagro, y Francisco Pizarro, quien por primera vez tenía el título de capitán.

En esta expedición, que duró 14 meses, se encontró con el padre Hernando de Luque a quien ya conocía anteriormente.

Aunque la famosa sociedad entre los tres no estaba aún realizada, ya se demostraban confianza y amistad.

Permaneció en la recién fundada ciudad Santa María la Antigua del Darién, ayudando a poblarla.

Sus dos primeras expediciones por esta zona, realizadas entre los años 1524-1525 y 1526-1528, revelaron las sorprendentes riquezas del Imperio incaico en las tierras recién descubiertas.

[2]​ Almagro permaneció en Panamá para reclutar hombres y conseguir avituallamiento, mientras Pizarro proseguía la expedición.

No obstante, cuando llegó al Perú en 1533, Pizarro, con poco más de 160 hombres, había capturado a Atahualpa, el gobernante absoluto del país, en Cajamarca, y estaba negociando un fabuloso rescate.

Después cuando el militar Quizquiz se levantó en armas contra los conquistadores, Almagro lo tomaría prisionero para enviarlo después al sur, a Jauja donde lo recibirían los propios soldados de su ejército para matarlo.

Según el derecho indiano, Almagro debería asegurar la conquista de ese territorio fundando tres poblaciones.

Los ejércitos se encontraron en Moche donde Alvarado pidió paso franco al darse cuenta de que llegaba tarde y no podría hacerles frente.

La disputa se hizo cada vez más acalorada y los dos antiguos socios, cada uno apoyado por sus propios simpatizantes, corrieron el riesgo de chocar varias veces, hasta que, estimulados por algunos personajes influyentes y respetables, llegaron a un acuerdo.

Almagro habría ido a las regiones del sur, en las que se suponía que había reinos tan ricos como el del Perú, y mientras tanto se habrían esperado las determinaciones de la Corona.

Iban también en la expedición unos 100 negros y unos 10 000 indios yanaconas para el transporte de las armas, ropas, víveres, etc.

Dejada atrás Molina, Almagro se encaminó por el Qhapaq Ñan, con los 50 hombres de que consistía su columna.

Recorrieron el área occidental del lago Titicaca, cruzaron el río Desaguadero y se encontró con Saavedra en un poblado llamado Paria, en que logró reunir a 50 españoles más, que pertenecían al grupo del capitán Gabriel de Rojas, y que decidieron abandonar a su jefe y dirigirse a Chile, se reunió un total de 150 hombres.

Pasado este contratiempo, se dirigieron a Tupiza, donde se encontraron con Paullu Inca y Vila Oma, que tenían recolectado oro de los tributos de la región, y con los tres españoles que los acompañaron.

Aquí Almagro realizó una nueva pausa de dos meses en la expedición, esperando que viniesen las tropas.

Pero Almagro y sus hombres siguieron adelante, ya que aún contaban con Paullu Inca.

Los españoles tuvieron que tomar porteadores a la fuerza para poder transportar los avituallamientos, esto causó más de un conflicto con los naturales.

[cita requerida] Las penurias aumentaron al internarse por ese paisaje helado, inhóspito y silencioso, llegando incluso a detener el avance por falta de ánimos.

[6]​ Por fin el resto de la columna llegó a Copayapu (Valle del Copiapó) con 240 españoles, 1500 yanaconas, 150 negros y 112 caballos.

Durante su marcha a esa región, el Adelantado tuvo noticias de un barco, el San Pedro, que había recalado en la región, (Los Vilos) dirigido por Ruy Díaz y que venía lleno de ropas, armas y víveres para la expedición.

Los naturales le hicieron caso, pero no se atrevieron a atacarlos y escaparon durante la noche, al igual que Felipillo y varios yanaconas, que tomaron el camino del norte, pero este último intento no fructificó.

Cuando la columna llegó al río Itata, tuvo lugar en Reinohuelén el primer enfrentamiento entre los españoles y los mapuches, en el que la superioridad de las armas y la sorpresa causada por los caballos permitió una fácil victoria española frente a los indígenas guerreros, que se asustaron al ver el hombre montado a caballo como si fuesen ambos un solo ser.

Entre la alternativa de volver a atravesar la cordillera, o dirigirse por el desierto, se decidió por la segunda opción.

Hecho prisionero, Almagro fue avergonzado por Hernando Pizarro y no pudo apelar ante el rey.