La respuesta hipersensible ( RH ) es un mecanismo utilizado por las plantas para prevenir la propagación de infecciones por patógenos microbianos . La RH se caracteriza por la muerte rápida de células en la región local que rodea una infección y sirve para restringir el crecimiento y la propagación de patógenos a otras partes de la planta. Es análoga al sistema inmunológico innato que se encuentra en los animales, y comúnmente precede a una respuesta sistémica (planta entera) más lenta, que finalmente conduce a la resistencia sistémica adquirida (SAR). [1] La RH se puede observar en la gran mayoría de especies de plantas y es inducida por una amplia gama de patógenos vegetales como oomicetos , virus , hongos e incluso insectos. [2]
Se piensa comúnmente que la HR es una estrategia de defensa eficaz contra los patógenos vegetales biotróficos , que requieren tejido vivo para obtener nutrientes . En el caso de los patógenos necrotróficos , la HR podría incluso ser beneficiosa para el patógeno , ya que requieren células vegetales muertas para obtener nutrientes . La situación se complica cuando se consideran patógenos como Phytophthora infestans que en las etapas iniciales de la infección actúan como biotrofos pero luego cambian a un estilo de vida necrotrófico. Se propone que en este caso la HR podría ser beneficiosa en las primeras etapas de la infección, pero no en las etapas posteriores. [3]
La primera idea de cómo se produce la respuesta hipersensible surgió del modelo gen por gen de Harold Henry Flor , quien postuló que por cada gen de resistencia (R) codificado por la planta, existe un gen de avirulencia (Avr) correspondiente codificado por el microbio . La planta es resistente al patógeno si tanto el gen Avr como el R están presentes durante la interacción planta-patógeno. [4] Los genes que participan en las interacciones planta-patógeno tienden a evolucionar a un ritmo muy rápido. [5]
Muy a menudo, la resistencia mediada por genes R se debe a que inducen HR, lo que conduce a la apoptosis . La mayoría de los genes R de las plantas codifican proteínas del receptor tipo NOD (NLR) . [6] La arquitectura del dominio de la proteína NLR consiste en un dominio NB-ARC que es un dominio de unión a nucleótidos , responsable de los cambios conformacionales asociados con la activación de la proteína NLR . En la forma inactiva, el dominio NB-ARC está unido al difosfato de adenosina (ADP). Cuando se detecta un patógeno , el ADP se intercambia por trifosfato de adenosina (ATP) y esto induce un cambio conformacional en la proteína NLR , que da como resultado HR. En el extremo N, el NLR tiene un dominio del receptor de interleucina Toll (TIR) (también encontrado en los receptores tipo Toll de mamíferos ) o un motivo de bobina enrollada (CC). Tanto los dominios TIR como CC están implicados en causar la muerte celular durante HR. El extremo C de los NLR consta de un motivo de repetición rico en leucina (LRR), que participa en la detección de los factores de virulencia del patógeno . [7]
La planta activa la HR cuando reconoce un patógeno . La identificación de un patógeno ocurre típicamente cuando un producto de un gen de virulencia , secretado por un patógeno , se une o interactúa indirectamente con el producto de un gen R de la planta . Los genes R son altamente polimórficos y muchas plantas producen varios tipos diferentes de productos de genes R , lo que les permite reconocer productos de virulencia producidos por muchos patógenos diferentes . [8]
En la fase uno de la HR, la activación de los genes R desencadena un flujo de iones , que implica un eflujo de hidróxido y potasio hacia el exterior de las células y una entrada de iones de calcio e hidrógeno hacia las células. [9]
En la segunda fase, las células implicadas en la HR generan un estallido oxidativo mediante la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), aniones superóxido , peróxido de hidrógeno , radicales hidroxilo y óxido nitroso . Estos compuestos afectan la función de la membrana celular , en parte al inducir la peroxidación lipídica y al causar daño lipídico. [9]
La alteración de los componentes iónicos en la célula y la descomposición de los componentes celulares en presencia de ROS dan como resultado la muerte de las células afectadas, así como la formación de lesiones locales . Las especies reactivas de oxígeno también desencadenan la deposición de lignina y calosa , así como la reticulación de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina preformadas , como P33, a la matriz de la pared a través de la tirosina en el motivo PPPPY. [9] Estos compuestos sirven para reforzar las paredes de las células que rodean la infección, creando una barrera e inhibiendo la propagación de la infección. [10] La activación de HR también da como resultado la alteración del citoesqueleto, la función mitocondrial y los cambios metabólicos, todos los cuales podrían estar implicados en la causa de la muerte celular. [11] [12] [13]
La HR se puede activar de dos formas principales: directa e indirectamente. La unión directa de los factores de virulencia a los NLR puede provocar la activación de la HR. Sin embargo, esto parece ser bastante raro. Más comúnmente, los factores de virulencia se dirigen a ciertas proteínas celulares que modifican y esta modificación es detectada por los NLR. El reconocimiento indirecto parece ser más común, ya que múltiples factores de virulencia pueden modificar la misma proteína celular con las mismas modificaciones, lo que permite que un receptor reconozca múltiples factores de virulencia . [14] A veces, los dominios proteicos a los que se dirigen los factores de virulencia se integran en los NLR. Un ejemplo de esto se puede observar en la resistencia de las plantas al patógeno del tizón del arroz , donde el NLR RGA5 tiene un dominio asociado a metales pesados (HMA) integrado en su estructura, que es el objetivo de múltiples proteínas efectoras . [15]
Un ejemplo de reconocimiento indirecto: AvrPphB es una proteína efectora de tipo III secretada por Pseudomonas syringae . Se trata de una proteasa que escinde una quinasa celular llamada PBS1. La quinasa modificada es detectada por RPS5 NLR. [16]
Estudios estructurales recientes de las proteínas CC-NLR han sugerido que después de que se detectan los factores de virulencia , las NLR se ensamblan en una estructura pentamérica conocida como resistosoma. El resistosoma parece tener una alta afinidad por la membrana celular . Cuando el resistosoma se ensambla, una hélice sobresale del extremo N de cada NLR y esto crea un poro en la membrana que permite que se produzca una fuga de iones y, por lo tanto, la célula muere . Sin embargo, este mecanismo solo se infiere a partir de la estructura y actualmente no hay estudios mecanísticos que lo respalden. Todavía no se sabe cómo se activan las proteínas TIR-NLR . Investigaciones recientes sugieren que requieren proteínas CC-NLR aguas abajo de ellas, que luego se activan para formar los resistosomas e inducir HR. [17]
Se sabe que los NLR pueden funcionar de forma individual, pero también hay casos en los que las proteínas NLR funcionan en pares. El par consta de un NLR sensor y un NLR auxiliar. El NLR sensor es responsable de reconocer la proteína efectora secretada por el patógeno y activar el NLR auxiliar que luego ejecuta la muerte celular . Los genes tanto del sensor como del NLR auxiliar respectivo suelen estar emparejados en el genoma y su expresión podría estar controlada por el mismo promotor . Esto permite que el par funcional, en lugar de componentes individuales, se segregue durante la división celular y también garantiza que se produzcan cantidades iguales de ambos NLR en la célula. [18]
Los pares de receptores funcionan a través de dos mecanismos principales: regulación negativa o cooperación.
En el escenario de regulación negativa, el NLR sensor es responsable de regular negativamente el NLR auxiliar y evitar la muerte celular en condiciones normales. Sin embargo, cuando la proteína efectora es introducida y reconocida por el NLR sensor, la regulación negativa del NLR auxiliar se alivia y se induce la HR. [19]
En los mecanismos de cooperación, cuando el NLR sensor reconoce la proteína efectora envía una señal al NLR auxiliar, activándolo así. [20]
Recientemente se ha descubierto que, además de actuar como singletons o pares, los NLR de las plantas pueden actuar en redes. En estas redes, normalmente hay muchos NLR de sensores emparejados con relativamente pocos NLR auxiliares. [20]
Un ejemplo de proteínas involucradas en redes NLR son aquellas pertenecientes al superclado NRC. Parece que las redes evolucionaron a partir de un evento de duplicación de un par de NLR genéticamente ligado a un locus no ligado que permitió que el nuevo par evolucionara para responder a un nuevo patógeno . Esta separación parece proporcionar plasticidad al sistema, ya que permite que los NLR sensores evolucionen más rápidamente en respuesta a la rápida evolución de los efectores del patógeno , mientras que el NLR auxiliar puede evolucionar mucho más lentamente para mantener su capacidad de inducir HR. Sin embargo, parece que durante la evolución también evolucionaron nuevos NLR auxiliares, supuestamente, porque ciertos NLR sensores requieren NLR auxiliares específicos para funcionar de manera óptima. [20]
El análisis bioinformático de los NLR de plantas ha demostrado que existe un motivo MADA conservado en el extremo N-terminal de los NLR auxiliares, pero no de los NLR sensores. Alrededor del 20 % de todos los NLR de CC tienen el motivo MADA, lo que implica la importancia del motivo para la ejecución de HR. [21]
La activación accidental de HR a través de las proteínas NLR podría causar una vasta destrucción del tejido vegetal, por lo tanto, los NLR se mantienen en una forma inactiva a través de una estricta regulación negativa tanto a nivel transcripcional como postraduccional . En condiciones normales, el ARNm de los NLR se transcribe a niveles muy bajos, lo que da como resultado bajos niveles de proteína en la célula. Los NLR también requieren una cantidad considerable de proteínas chaperonas para su plegamiento. Las proteínas mal plegadas son inmediatamente ubiquitinadas y degradadas por el proteasoma . [22] Se ha observado que en muchos casos, si se eliminan las proteínas chaperonas involucradas en la biosíntesis de NLR , HR se elimina y los niveles de NLR se reducen significativamente. [23]
Las interacciones intramoleculares también son esenciales para la regulación de la HR. Las proteínas NLR no son lineales: el dominio NB-ARC está intercalado entre los dominios LRR y TIR / CC . En condiciones normales, hay mucho más ATP presente en el citoplasma que ADP , y esta disposición de las proteínas NLR impide el intercambio espontáneo de ADP por ATP y, por lo tanto, la activación de la HR. Solo cuando se detecta un factor de virulencia , el ADP se intercambia por ATP . [14]
Las mutaciones en ciertos componentes de la maquinaria de defensa de las plantas hacen que la HR se active sin la presencia de proteínas efectoras del patógeno . Algunas de estas mutaciones se observan en los genes NLR y hacen que estas proteínas NLR se vuelvan autoactivas debido a la alteración de los mecanismos reguladores intramoleculares. Otras mutaciones que causan HR espontánea están presentes en proteínas involucradas en la producción de ROS durante la invasión de patógenos . [3]
La HR también es un proceso sensible a la temperatura y se ha observado que en muchos casos las interacciones planta-patógeno no inducen HR a temperaturas superiores a 30 °C, lo que posteriormente conduce a una mayor susceptibilidad al patógeno . [24] Los mecanismos detrás de la influencia de la temperatura en la resistencia de la planta a los patógenos no se entienden en detalle, sin embargo, la investigación sugiere que los niveles de proteína NLR podrían ser importantes en esta regulación. [25] También se propone que a temperaturas más altas las proteínas NLR tienen menos probabilidades de formar complejos oligoméricos , inhibiendo así su capacidad para inducir HR. [26]
También se ha demostrado que la HR depende de las condiciones de luz, lo que podría estar relacionado con la actividad de los cloroplastos y principalmente con su capacidad para generar ROS . [27]
Se ha demostrado que varias enzimas intervienen en la generación de ROS . Por ejemplo, la aminooxidasa de cobre cataliza la desaminación oxidativa de poliaminas , especialmente putrescina , y libera los mediadores de ROS peróxido de hidrógeno y amoníaco . [28] Otras enzimas que se cree que desempeñan un papel en la producción de ROS incluyen la xantina oxidasa , la NADPH oxidasa , la oxalato oxidasa, las peroxidasas y las aminooxidasas que contienen flavina . [9]
En algunos casos, las células que rodean la lesión sintetizan compuestos antimicrobianos , entre ellos fenólicos , fitoalexinas y proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) , entre ellas β-glucanasas y quitinasas . Estos compuestos pueden actuar perforando las paredes celulares bacterianas , o bien retrasando la maduración, alterando el metabolismo o impidiendo la reproducción del patógeno en cuestión.
Los estudios han sugerido que el modo y la secuencia reales del desmantelamiento de los componentes celulares de las plantas dependen de cada interacción individual entre planta y patógeno, pero todas las HR parecen requerir la participación de las proteasas de cisteína . La inducción de la muerte celular y la eliminación de patógenos también requiere una síntesis activa de proteínas , un citoesqueleto de actina intacto y la presencia de ácido salicílico . [8]
Los patógenos han desarrollado varias estrategias para suprimir las respuestas de defensa de las plantas. Los procesos del huésped que suelen ser el objetivo de las bacterias incluyen: alteraciones de las vías de muerte celular programada , inhibición de las defensas basadas en la pared celular y alteración de la señalización de las hormonas vegetales y la expresión de genes de defensa . [29]
Se ha demostrado que la iniciación local de HR en respuesta a ciertos patógenos necrotróficos permite que las plantas desarrollen inmunidad sistémica contra el patógeno . [30] Los científicos han estado tratando de explotar la capacidad de HR para inducir resistencia sistémica en plantas con el fin de crear plantas transgénicas resistentes a ciertos patógenos . Los promotores inducibles por patógenos se han vinculado a genes NLR autoactivos para inducir la respuesta de HR solo cuando el patógeno está presente, pero no en ningún otro momento. Sin embargo, este enfoque ha sido en su mayoría inviable ya que la modificación también conduce a una reducción sustancial en los rendimientos de las plantas. [3]
Se ha observado en Arabidopsis que, a veces, cuando se cruzan dos líneas de plantas diferentes, la descendencia muestra signos de necrosis híbrida . Esto se debe a que las plantas progenitoras contienen NLR incompatibles, que, cuando se expresan juntas en la misma célula, inducen HR espontánea. [31]
Esta observación planteó la hipótesis de que los patógenos de las plantas pueden conducir a la especiación de las plantas: si las poblaciones de plantas de la misma especie desarrollan NLR incompatibles en respuesta a diferentes efectores patógenos , esto puede conducir a una necrosis híbrida en la descendencia F1 , lo que reduce sustancialmente la aptitud de la descendencia y el flujo genético a las generaciones posteriores. [32]
Tanto las plantas como los animales tienen proteínas NLR que parecen tener la misma función biológica: inducir la muerte celular . Los extremos N de las NLR de plantas y animales varían, pero parece que ambas tienen dominios LRR en el extremo C. [33]
Una gran diferencia entre los NLR animales y vegetales es lo que reconocen. Los NLR animales reconocen principalmente patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), mientras que los NLR vegetales reconocen principalmente proteínas efectoras de patógenos . Esto tiene sentido ya que los NLR están presentes dentro de la célula y las plantas rara vez tienen patógenos intracelulares , excepto los virus y los virus no tienen PAMP ya que evolucionan rápidamente. Los animales, por otro lado, tienen patógenos intracelulares . [34]
La gran mayoría de los linajes de plantas, a excepción de ciertas algas , como Chlamydomonas , tienen NLR. Los NLR también están presentes en muchas especies animales , sin embargo, no están presentes en, por ejemplo, Drosophila melanogaster y Artrópodos . [33]
Tras el reconocimiento de los PAMP por los NLR en animales, los NLR se oligomerizan para formar una estructura conocida como inflamasoma , que activa la piroptosis . En plantas, estudios estructurales han sugerido que los NLR también se oligomerizan para formar una estructura llamada resistosoma, que también conduce a la muerte celular . Parece que tanto en plantas como en animales, la formación del resistosoma o del inflamasoma , respectivamente, conduce a la muerte celular mediante la formación de poros en la membrana . Se infiere a partir de las estructuras de las proteínas que en las plantas los propios NLR son responsables de la formación de poros en la membrana , mientras que en el caso del inflamasoma , la actividad formadora de poros surge de la gasdermina D que es escindida por caspasas como resultado de la oligomerización de los NLR. [35] [36] Las células vegetales no tienen caspasas . [37]