La transcriptasa inversa de la telomerasa (abreviada como TERT o hTERT en humanos) es una subunidad catalítica de la enzima telomerasa que, junto con el componente ARN de la telomerasa (TERC), comprende la unidad más importante del complejo de la telomerasa. [5] [6]
Las telomerasas forman parte de un subgrupo distinto de polimerasas dependientes de ARN. La telomerasa alarga los telómeros en las cadenas de ADN , lo que permite que las células senescentes que de otro modo se volverían posmitóticas y sufrirían apoptosis superen el límite de Hayflick y se vuelvan potencialmente inmortales, como suele suceder con las células cancerosas. Para ser más específicos, TERT es responsable de catalizar la adición de nucleótidos en una secuencia TTAGGG a los extremos de los telómeros de un cromosoma . [7] Esta adición de secuencias repetitivas de ADN evita la degradación de los extremos cromosómicos después de múltiples rondas de replicación. [8]
La ausencia de hTERT (generalmente como resultado de una mutación cromosómica ) se asocia con el trastorno Cri du chat . [9] [10]
La telomerasa es una polimerasa de ribonucleoproteína que mantiene los extremos de los telómeros mediante la adición de la repetición de telómero TTAGGG. La enzima consta de un componente proteico con actividad de transcriptasa inversa , codificado por este gen, y un componente de ARN que sirve como plantilla para la repetición de telómero. La expresión de la telomerasa desempeña un papel en la senescencia celular, ya que normalmente se reprime en las células somáticas posnatales , lo que resulta en un acortamiento progresivo de los telómeros. Los estudios en ratones sugieren que la telomerasa también participa en la reparación cromosómica, ya que la síntesis de novo de repeticiones de telómeros puede ocurrir en roturas de doble cadena . Se han identificado variantes empalmadas alternativamente que codifican diferentes isoformas de la transcriptasa inversa de la telomerasa; no se ha determinado la secuencia completa de algunas variantes. Se cree que el empalme alternativo en este locus es un mecanismo de regulación de la actividad de la telomerasa. [11]
El gen hTERT, ubicado en el cromosoma 5, consta de 16 exones y 15 intrones que abarcan 35 kb. El promotor central de hTERT incluye 330 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio de la traducción (AUG ya que es ARN al usar las palabras "exones" e "intrones"), así como 37 pares de bases del exón 2 del gen hTERT. [12] [13] [14] El promotor hTERT es rico en GC y carece de cajas TATA y CAAT pero contiene muchos sitios para varios factores de transcripción dando indicación de un alto nivel de regulación por múltiples factores en muchos contextos celulares. [12] Los factores de transcripción que pueden activar hTERT incluyen muchos oncogenes (genes que causan cáncer) como c-Myc , Sp1 , HIF-1 , AP2 y muchos más, mientras que muchos genes supresores del cáncer como p53 , WT1 y Menin producen factores que suprimen la actividad de hTERT. [14] [15] Otra forma de regulación positiva es a través de la desmetilación de histonas proximales a la región promotora , imitando la baja densidad de histonas trimetiladas observadas en células madre embrionarias . [16] Esto permite el reclutamiento de la histona acetiltransferasa (HAT) para desenrollar la secuencia permitiendo la transcripción del gen. [15]
La deficiencia de telómeros a menudo se relaciona con el envejecimiento, los cánceres y las afecciones disqueratosis congénita (DKC) y Cri du chat . Mientras tanto, la sobreexpresión de hTERT a menudo se asocia con cánceres y formación de tumores. [9] [17] [18] [19] La regulación de hTERT es extremadamente importante para el mantenimiento de células madre y cancerosas y se puede utilizar de múltiples maneras en el campo de la medicina regenerativa .
La hTERT suele estar regulada positivamente en células que se dividen rápidamente, incluidas tanto las células madre embrionarias como las células madre adultas . [18] Alarga los telómeros de las células madre , lo que, como consecuencia, aumenta la vida útil de las células madre al permitir una división indefinida sin acortamiento de los telómeros. Por lo tanto, es responsable de las propiedades de autorrenovación de las células madre. Se ha descubierto que la telomerasa se dirige específicamente a los telómeros más cortos en lugar de a los más largos, debido a varios mecanismos reguladores dentro de las células que reducen la afinidad de la telomerasa por los telómeros más largos. Esta afinidad preferencial mantiene un equilibrio dentro de la célula de modo que los telómeros tienen la longitud suficiente para su función y, sin embargo, al mismo tiempo, no contribuyen a la elongación aberrante de los telómeros. [20]
La expresión elevada de hTERT también se utiliza a menudo como un indicador del estado de pluripotencia y multipotencia de las células madre embrionarias y adultas. Se ha descubierto que la sobreexpresión de hTERT inmortaliza ciertos tipos de células y confiere diferentes propiedades interesantes a diferentes células madre. [14] [21]
hTERT inmortaliza varias células normales en cultivo, otorgando así las propiedades de autorrenovación de las células madre a cultivos de células no madre. [14] [22] Hay múltiples formas en las que se puede lograr la inmortalización de células no madre, una de las cuales es mediante la introducción de hTERT en las células. Las células diferenciadas a menudo expresan hTERC y TP1, una proteína asociada a la telomerasa que ayuda a formar el ensamblaje de la telomerasa, pero no expresa hTERT. Por lo tanto, hTERT actúa como factor limitante para la actividad de la telomerasa en células diferenciadas. [14] [23] Sin embargo, con la sobreexpresión de hTERT, se puede formar telomerasa activa en células diferenciadas. Este método se ha utilizado para inmortalizar células epiteliales de próstata y derivadas del estroma, que normalmente son difíciles de cultivar in vitro . La introducción de hTERT permite el cultivo in vitro de estas células y está disponible para posibles investigaciones futuras. La introducción de hTERT tiene una ventaja sobre el uso de proteína viral para la inmortalización, ya que no implica la inactivación del gen supresor de tumores , lo que podría conducir a la formación de cáncer. [22]
La sobreexpresión de hTERT en células madre cambia las propiedades de las células. [21] [24] La sobreexpresión de hTERT aumenta las propiedades de las células madre de las células madre mesenquimales humanas . El perfil de expresión de las células madre mesenquimales converge hacia las células madre embrionarias, lo que sugiere que estas células pueden tener propiedades similares a las de las células madre embrionarias. Sin embargo, se ha observado que las células madre mesenquimales experimentan niveles reducidos de diferenciación espontánea . [21] Esto sugiere que la capacidad de diferenciación de las células madre adultas puede depender de las actividades de la telomerasa. Por lo tanto, la sobreexpresión de hTERT, que es similar al aumento de las actividades de la telomerasa, puede crear células madre adultas con una mayor capacidad de diferenciación y, por lo tanto, una mayor capacidad de tratamiento.
El aumento de la actividad de la telomerasa en las células madre produce diferentes efectos según la naturaleza intrínseca de los diferentes tipos de células madre. [18] Por lo tanto, no todas las células madre tendrán mayores propiedades de células madre. Por ejemplo, la investigación ha demostrado que la telomerasa puede ser regulada positivamente en las células de sangre del cordón umbilical CD34+ a través de la sobreexpresión de hTERT. La supervivencia de estas células madre mejoró, aunque no hubo un aumento en la cantidad de duplicación de la población. [24]
La desregulación de la expresión de la telomerasa en las células somáticas puede estar implicada en la oncogénesis . [11]
Los estudios de asociación del genoma completo sugieren que TERT es un gen de susceptibilidad para el desarrollo de muchos tipos de cáncer, [25] incluido el cáncer de pulmón. [26]
La actividad de la telomerasa está asociada con el número de veces que una célula puede dividirse, desempeñando un papel importante en la inmortalidad de las líneas celulares, como las células cancerosas . El complejo enzimático actúa mediante la adición de repeticiones teloméricas a los extremos del ADN cromosómico. Esto genera células cancerosas inmortales. [27] De hecho, existe una fuerte correlación entre la actividad de la telomerasa y los tumores malignos o las líneas celulares cancerosas. [28] No todos los tipos de cáncer humano tienen una mayor actividad de la telomerasa. El 90% de los cánceres se caracterizan por una mayor actividad de la telomerasa. [28] El cáncer de pulmón es el tipo de cáncer mejor caracterizado asociado con la telomerasa. [29] Hay una falta de actividad sustancial de la telomerasa en algunos tipos de células, como los fibroblastos humanos primarios , que se vuelven senescentes después de aproximadamente 30 a 50 duplicaciones de la población. [28] También hay evidencia de que la actividad de la telomerasa aumenta en los tejidos, como las líneas de células germinales , que se auto-renuevan. Las células somáticas normales , por otro lado, no tienen actividad de telomerasa detectable. [30] Dado que el componente catalítico de la telomerasa es su transcriptasa inversa, hTERT, y el componente de ARN hTERC, hTERT es un gen importante para investigar en términos de cáncer y tumorigénesis .
El gen hTERT ha sido examinado en busca de mutaciones y su asociación con el riesgo de contraer cáncer. Se han encontrado más de doscientas combinaciones de polimorfismos de hTERT y desarrollo de cáncer. [29] Hubo varios tipos diferentes de cáncer involucrados, y la fuerza de la correlación entre el polimorfismo y el desarrollo de cáncer varió de débil a fuerte. [29] La regulación de hTERT también se ha investigado para determinar posibles mecanismos de activación de la telomerasa en células cancerosas. Es importante destacar que las mutaciones en el promotor de hTERT se identificaron por primera vez en el melanoma y posteriormente se demostró que eran las mutaciones no codificantes más comunes en el cáncer. [31] La glucógeno sintasa quinasa 3 ( GSK3 ) parece estar sobreexpresada en la mayoría de las células cancerosas. [27] GSK3 está involucrada en la activación del promotor a través del control de una red de factores de transcripción . [ 27] La leptina también está involucrada en el aumento de la expresión de ARNm de hTERT a través del transductor de señales y la activación de la transcripción 3 ( STAT3 ), proponiendo un mecanismo para el aumento de la incidencia de cáncer en individuos obesos. [27] Hay varios otros mecanismos reguladores que están alterados o son aberrantes en las células cancerosas, incluida la vía de señalización Ras y otros reguladores transcripcionales. [27] La fosforilación también es un proceso clave de modificación postranscripcional que regula la expresión de ARNm y la localización celular. [27] Claramente, hay muchos mecanismos reguladores de activación y represión de hTERT y la actividad de la telomerasa en la célula, proporcionando métodos de inmortalización en células cancerosas.
Si el aumento de la actividad de la telomerasa se asocia con la malignidad , entonces los posibles tratamientos del cáncer podrían implicar la inhibición de su componente catalítico, hTERT, para reducir la actividad de la enzima y causar la muerte celular. Dado que las células somáticas normales no expresan TERT, la inhibición de la telomerasa en las células cancerosas puede causar senescencia y apoptosis sin afectar a las células humanas normales. [27] Se ha descubierto que los mutantes dominantes negativos de hTERT podrían reducir la actividad de la telomerasa dentro de la célula. [28] Esto llevó a la apoptosis y la muerte celular en células con longitudes de telómero cortas , un resultado prometedor para el tratamiento del cáncer. [28] Aunque las células con telómeros largos no experimentaron apoptosis, desarrollaron características mortales y sufrieron un acortamiento de los telómeros. [28] También se ha descubierto que la actividad de la telomerasa se ve inhibida por fitoquímicos como los isoprenoides , la genisteína , la curcumina , etc. [27] Estos productos químicos desempeñan un papel en la inhibición de la vía mTOR a través de la regulación negativa de la fosforilación. [27] La vía mTOR es muy importante en la regulación de la síntesis de proteínas e interactúa con la telomerasa para aumentar su expresión. [27] Se ha descubierto que varios otros productos químicos inhiben la actividad de la telomerasa y actualmente se están probando como posibles opciones de tratamiento clínico, como los análogos de nucleósidos , los derivados del ácido retinoico , los antibióticos quinolónicos y los derivados de la catequina . [30] También existen otros métodos basados en la genética molecular para inhibir la telomerasa, como la terapia antisentido y la interferencia del ARN . [30]
Se ha demostrado que los fragmentos de péptidos hTERT inducen una reacción de células T citotóxicas contra células tumorales telomerasa-positivas in vitro . [32] La respuesta está mediada por células dendríticas , que pueden mostrar antígenos asociados a hTERT en receptores MHC clase I y II después de la transducción adenoviral de un plásmido hTERT en células dendríticas, que median las respuestas de las células T. [33] Las células dendríticas pueden presentar antígenos asociados a la telomerasa incluso con cantidades indetectables de actividad de la telomerasa, siempre que el plásmido hTERT esté presente. [34] La inmunoterapia contra células tumorales telomerasa-positivas es un campo prometedor en la investigación del cáncer que ha demostrado ser eficaz en estudios in vitro y en modelos de ratón . [35]
Las células madre pluripotentes inducidas (células iPS) son células somáticas que han sido reprogramadas a un estado similar al de las células madre mediante la introducción de cuatro factores ( Oct3/4 , Sox2 , Klf4 y c-Myc ). [36] Las células iPS tienen la capacidad de autorenovarse indefinidamente y contribuir a las tres capas germinales cuando se implantan en un blastocisto o se utilizan en la formación de teratomas . [36]
El desarrollo temprano de líneas de células iPS no fue eficiente, ya que produjeron hasta un 5% de células somáticas reprogramadas con éxito en un estado similar a las células madre. [37] Al utilizar células somáticas inmortalizadas (células diferenciadas con hTERT regulado positivamente ), la reprogramación de células iPS aumentó veinte veces en comparación con la reprogramación utilizando células mortales. [37]
La reactivación de hTERT, y posteriormente de la telomerasa , en células iPS humanas se ha utilizado como una indicación de pluripotencia y reprogramación a un estado similar a las células madre embrionarias ( ES ) cuando se utilizan células mortales. [36] Las células reprogramadas que no expresan suficientes niveles de hTERT entran en un estado inactivo después de una serie de replicaciones dependiendo de la longitud de los telómeros, manteniendo al mismo tiempo capacidades similares a las de las células madre para diferenciarse. [37] La reactivación de la actividad de TERT se puede lograr utilizando solo tres de los cuatro factores de reprogramación descritos por Takahashi y Yamanaka: para ser específicos, Oct3/4 , Sox2 y Klf4 son esenciales, mientras que c-Myc no lo es. [16] Sin embargo, este estudio se realizó con células que contenían niveles endógenos de c-Myc que pueden haber sido suficientes para la reprogramación.
La longitud de los telómeros en las células adultas sanas se alarga y adquiere características epigenéticas similares a las de las células madre embrionarias cuando se las reprograma como células iPS. Algunas características epigenéticas de las células madre embrionarias incluyen una baja densidad de histonas trimetiladas H3K9 y H4K20 en los telómeros, así como una mayor cantidad detectable de transcripciones de TERT y actividad proteica. [16] Sin la restauración de TERT y las proteínas telomerasas asociadas, la eficiencia de las células iPS se reduciría drásticamente. Las células iPS también perderían la capacidad de autorrenovarse y eventualmente envejecerían . [16]
Los pacientes con DKC ( disqueratosis congénita ) se caracterizan por un mantenimiento defectuoso de los telómeros que conduce a problemas con la regeneración de células madre . [17] Las células iPS derivadas de pacientes con DKC con una mutación heterocigótica en el gen TERT muestran una reducción del 50% en la actividad de la telomerasa en comparación con las células iPS de tipo salvaje . [38] Por el contrario, las mutaciones en el gen TERC (porción de ARN del complejo de la telomerasa) se pueden superar mediante la regulación positiva debido a la reprogramación siempre que el gen hTERT esté intacto y sea funcional. [39] Por último, las células iPS generadas con células DKC con un gen de disquerina mutado (DKC1) no pueden ensamblar el complejo hTERT/ARN y, por lo tanto, no tienen telomerasa funcional. [38]
La funcionalidad y eficiencia de una célula iPS reprogramada está determinada por la capacidad de la célula para reactivar el complejo de la telomerasa y alargar sus telómeros, permitiendo la autorrenovación. hTERT es un componente limitante importante del complejo de la telomerasa y una deficiencia de hTERT intacta impide la actividad de la telomerasa, lo que hace que las células iPS sean una vía inadecuada para la terapia de los trastornos con deficiencia de telómeros. [38]
Aunque el mecanismo no se entiende completamente, la exposición de células hematopoyéticas deficientes en TERT a los andrógenos resultó en un aumento del nivel de actividad de TERT. [40] Las células con una mutación heterocigótica de TERT, como las de los pacientes con DKC (disqueratosis congénita) , que normalmente presentan niveles basales bajos de TERT, podrían restaurarse a niveles normales comparables a los de las células de control. Los niveles de ARNm de TERT también aumentan con la exposición a los andrógenos. [40] La terapia con andrógenos puede convertirse en un método adecuado para tratar enfermedades circulatorias como la degeneración de la médula ósea y el bajo recuento sanguíneo vinculado con DKC y otras afecciones deficientes en telomerasa. [40]
A medida que los organismos envejecen y las células proliferan, los telómeros se acortan con cada ronda de replicación. Las células restringidas a un linaje específico son capaces de dividirse solo un número determinado de veces, determinado por la longitud de los telómeros, antes de envejecer . [41] El agotamiento y la pérdida de la protección de los telómeros se ha relacionado con la degeneración, el fracaso y la fibrosis de los órganos debido a que los progenitores se vuelven inactivos e incapaces de diferenciarse . [20] [41] Utilizando un modelo de ratón deficiente en TERT in vivo , la reactivación del gen TERT en poblaciones inactivas en múltiples órganos reactivó la telomerasa y restauró las capacidades de las células para diferenciarse . [42] La reactivación de TERT regula a la baja las señales de daño del ADN asociadas con los puntos de control mitóticos celulares, lo que permite la proliferación y eliminación de un fenotipo degenerativo . [42] En otro estudio, la introducción del gen TERT en ratones sanos de un año de edad utilizando un virus adenoasociado modificado condujo a un aumento del 24% en la esperanza de vida, sin ningún aumento en el cáncer. [43]
Paradójicamente, las variantes genéticas en el locus TERT, que están asociadas con una mayor longitud de los telómeros leucocitarios, están asociadas con tasas de envejecimiento epigenético más rápidas en la sangre según un biomarcador molecular del envejecimiento conocido como reloj epigenético . [44] De manera similar, la expresión de TERT humano no detuvo el envejecimiento epigenético en fibroblastos humanos. [44]
El gen hTERT se ha convertido en un foco principal para la terapia génica que involucra el cáncer debido a su expresión en células tumorales pero no en células adultas somáticas . [45] Un método es prevenir la traducción del ARNm de hTERT mediante la introducción de ARNi , que son secuencias complementarias que se unen al ARNm impidiendo el procesamiento del gen después de la transcripción . [46] Este método no elimina la actividad de la telomerasa , pero sí reduce la actividad de la telomerasa y los niveles de ARNm de hTERT observados en el citoplasma . [46] Se observaron mayores tasas de éxito in vitro al combinar el uso de secuencias hTERT antisentido con la introducción de un plásmido supresor de tumores mediante infección por adenovirus como PTEN . [47]
Otro método que se ha estudiado es la manipulación del promotor hTERT para inducir la apoptosis en células tumorales. Se pueden fabricar secuencias de ADN plasmídico utilizando el promotor hTERT seguido de genes que codifican proteínas específicas. La proteína puede ser una toxina, un factor apoptótico o una proteína viral. Las toxinas como la toxina de la difteria interfieren con los procesos celulares y finalmente inducen la apoptosis. [45] Los factores de muerte apoptótica como FADD (proteína asociada a Fas con dominio de muerte) se pueden utilizar para obligar a las células que expresan hTERT a sufrir apoptosis. [48] Las proteínas virales como la timidina quinasa viral se pueden utilizar para la orientación específica de un fármaco. [49] Al introducir un profármaco activado únicamente por la enzima viral, se puede lograr la orientación específica de las células que expresan hTERT. [49] Al utilizar el promotor hTERT, solo se verán afectadas las células que expresan hTERT y esto permite la orientación específica de las células tumorales. [45] [48] [49]
Además de las terapias contra el cáncer, el gen hTERT se ha utilizado para promover el crecimiento de los folículos pilosos. [50] A continuación se muestra una animación esquemática para la terapia genética.
Se ha demostrado que la transcriptasa inversa de la telomerasa interactúa con: