En biología, la reprogramación se refiere al borrado y remodelación de marcas epigenéticas , como la metilación del ADN , durante el desarrollo de mamíferos o en cultivos celulares. [1] Este control también suele estar asociado con modificaciones covalentes alternativas de las histonas .
En los mamíferos, en tres etapas de la vida, se producen reprogramaciones a gran escala (entre el 10% y el 100% de las marcas epigenéticas) y rápidas (entre horas y unos pocos días). Casi el 100% de las marcas epigenéticas se reprograman en dos breves períodos al principio del desarrollo, tras la fecundación de un óvulo por un espermatozoide . Además, casi el 10% de las metilaciones del ADN en las neuronas del hipocampo pueden alterarse rápidamente durante la formación de una fuerte memoria del miedo.
Después de la fertilización en los mamíferos, los patrones de metilación del ADN se borran en gran medida y luego se restablecen durante el desarrollo embrionario temprano. Casi todas las metilaciones de los padres se borran, primero durante la embriogénesis temprana y nuevamente en la gametogénesis , con desmetilación y remetilación ocurriendo cada vez. La desmetilación durante la embriogénesis temprana ocurre en el período de preimplantación. Después de que un espermatozoide fecunda un óvulo para formar un cigoto , se produce una rápida desmetilación del ADN paterno y una desmetilación más lenta del ADN materno hasta la formación de una mórula , que casi no tiene metilación. Después de que se forma el blastocisto , puede comenzar la metilación y, con la formación del epiblasto, se produce una ola de metilación hasta la etapa de implantación del embrión. Otro período de desmetilación rápida y casi completa ocurre durante la gametogénesis dentro de las células germinales primordiales (PGC). Aparte de las PGC, en la etapa posterior a la implantación, los patrones de metilación en las células somáticas son específicos de la etapa y del tejido , con cambios que presumiblemente definen cada tipo de célula individual y duran de manera estable durante un largo tiempo. [2]
El genoma del esperma de ratón está metilado en un 80-90% en sus sitios CpG en el ADN, lo que asciende a unos 20 millones de sitios metilados. [ cita requerida ] Después de la fertilización , el cromosoma paterno se desmetila casi por completo en seis horas mediante un proceso activo, antes de la replicación del ADN (línea azul en la Figura). En el ovocito maduro , alrededor del 40% de sus sitios CpG están metilados. La desmetilación del cromosoma materno se produce en gran medida por el bloqueo de las enzimas metilantes que actúan sobre el ADN de origen materno y por la dilución del ADN materno metilado durante la replicación (línea roja en la Figura). La mórula (en la etapa de 16 células), tiene solo una pequeña cantidad de metilación del ADN (línea negra en la Figura). La metilación comienza a aumentar a los 3,5 días después de la fertilización en el blastocisto , y luego ocurre una gran ola de metilación en los días 4,5 a 5,5 en el epiblasto , pasando del 12% al 62% de metilación y alcanzando el nivel máximo después de la implantación en el útero. [3] Para el día siete después de la fertilización, las células germinales primordiales (PGC) recién formadas en el embrión implantado se segregan de las células somáticas restantes . En este punto, las PGC tienen aproximadamente el mismo nivel de metilación que las células somáticas.
Las células germinales primordiales (PGC) recién formadas en el embrión implantado se derivan de las células somáticas. En este punto, las PGC tienen altos niveles de metilación. Estas células migran desde el epiblasto hacia la cresta gonadal . Ahora las células están proliferando rápidamente y comienzan la desmetilación en dos oleadas. En la primera oleada, la desmetilación se produce por dilución replicativa, pero en la segunda oleada la desmetilación se produce por un proceso activo. La segunda oleada conduce a la desmetilación de loci específicos . En este punto, los genomas de las PGC muestran los niveles más bajos de metilación del ADN de todas las células en todo el ciclo de vida [en el día embrionario 13,5 (E13,5), consulte la segunda figura de esta sección]. [4]
Tras la fecundación, algunas células del embrión recién formado migran a la cresta germinal y acaban convirtiéndose en las células germinales (espermatozoides y ovocitos) de la siguiente generación. Debido al fenómeno de la impronta genómica , los genomas materno y paterno se marcan de forma diferencial y deben reprogramarse adecuadamente cada vez que pasan por la línea germinal. Por tanto, durante el proceso de gametogénesis , las células germinales primordiales deben tener sus patrones originales de metilación del ADN biparental borrados y restablecidos en función del sexo del progenitor transmisor.
Después de la fertilización, los genomas paterno y materno son desmetilados con el fin de borrar sus firmas epigenéticas y adquirir totipotencia . En este punto hay una asimetría: el pronúcleo masculino sufre una desmetilación rápida y activa, mientras que el pronúcleo femenino se desmetila pasivamente durante las divisiones celulares consecutivas. El proceso de desmetilación del ADN implica la reparación por escisión de bases y probablemente otros mecanismos basados en la reparación del ADN. [5] A pesar de la naturaleza global de este proceso, hay ciertas secuencias que lo evitan, como las regiones metiladas diferencialmente (DMRS) asociadas a genes impresos, retrotransposones y heterocromatina centromérica . La remetilación es necesaria de nuevo para diferenciar el embrión en un organismo completo. [6]
Se ha demostrado que la manipulación in vitro de embriones preimplantacionales altera los patrones de metilación en los loci impresos [7] y desempeña un papel crucial en los animales clonados. [8]
El aprendizaje y la memoria tienen niveles de permanencia, a diferencia de otros procesos mentales como el pensamiento, el lenguaje y la conciencia, que son de naturaleza temporal. El aprendizaje y la memoria pueden acumularse de forma lenta (tablas de multiplicar) o rápida (tocar una estufa caliente), pero una vez alcanzados, pueden recuperarse para un uso consciente durante mucho tiempo. Las ratas sometidas a una instancia de condicionamiento del miedo contextual crean una memoria a largo plazo especialmente fuerte. A las 24 h después del entrenamiento, se encontró que el 9,17% de los genes en los genomas de las neuronas del hipocampo de las ratas estaban metilados de forma diferencial . Esto incluía más de 2000 genes metilados de forma diferencial a las 24 horas después del entrenamiento, y más de 500 genes estaban desmetilados. [9] La región del hipocampo del cerebro es donde se almacenan por primera vez los recuerdos del miedo contextual (véase la figura del cerebro, en esta sección), pero este almacenamiento es transitorio y no permanece en el hipocampo. En las ratas, el condicionamiento del miedo contextual se elimina cuando el hipocampo se somete a una hipocampectomía apenas un día después del condicionamiento, pero las ratas retienen una cantidad considerable de miedo contextual cuando se impone un retraso prolongado (28 días) entre el momento del condicionamiento y el momento de la hipocampectomía. [10]
Para la reprogramación del metiloma del ADN se requieren tres etapas moleculares . Etapa 1: Reclutamiento. Las enzimas necesarias para la reprogramación se reclutan en los sitios del genoma que requieren desmetilación o metilación. Etapa 2: Implementación. Tienen lugar las reacciones enzimáticas iniciales. En el caso de la metilación, se trata de un paso corto que da como resultado la metilación de la citosina a 5-metilcitosina . Etapa 3: Reparación del ADN por escisión de bases . Los productos intermedios de la desmetilación son catalizados por enzimas específicas de la vía de reparación del ADN por escisión de bases que finalmente restauran la cistosina en la secuencia de ADN.
La figura de esta sección indica los papeles centrales de las metilcitosina dioxigenasas de translocación diez-once (TET) en la desmetilación de la 5-metilcitosina para formar citosina. [12] Como se revisó en 2018, [12] la 5mC es oxidada inicialmente por las dioxigenasas TET para generar 5-hidroximetilcitosina (5hmC). En pasos sucesivos (ver Figura) las enzimas TET hidroxilan aún más la 5hmC para generar 5-formilcitosina (5fC) y 5-carboxilcitosina (5caC). La timina-ADN glicosilasa (TDG) reconoce las bases intermedias 5fC y 5caC y escinde el enlace glucosídico dando como resultado un sitio apirimidínico (sitio AP). En una vía de desaminación oxidativa alternativa, las desaminasas APOBEC (AID/APOBEC) pueden desaminar oxidativamente el 5hmC para formar 5-hidroximetiluracilo (5hmU) o el 5mC puede convertirse en timina (Thy). El 5hmU puede escindirse mediante TDG, SMUG1 , NEIL1 o MBD4 . Los sitios AP y los desajustes T:G se reparan luego mediante enzimas de reparación por escisión de bases (BER) para producir citosina (Cyt).
Las isoformas de las enzimas TET incluyen al menos dos isoformas de TET1, una de TET2 y tres isoformas de TET3 . [13] [14] La isoforma canónica TET1 de longitud completa parece estar prácticamente restringida a embriones tempranos, células madre embrionarias y células germinales primordiales (PGC). La isoforma TET1 dominante en la mayoría de los tejidos somáticos, al menos en el ratón, surge del uso de un promotor alternativo que da lugar a una transcripción corta y una proteína truncada designada TET1s. Las isoformas de TET3 son la forma de longitud completa TET3FL, una variante de empalme de forma corta TET3s y una forma que se produce en ovocitos y neuronas designada TET3o. TET3o se crea mediante el uso de un promotor alternativo y contiene un primer exón N-terminal adicional que codifica 11 aminoácidos . La TET3o solo se encuentra en ovocitos y neuronas y no se expresó en células madre embrionarias ni en ningún otro tipo de célula o tejido de ratón adulto analizado. Mientras que la expresión de TET1 apenas se puede detectar en ovocitos y cigotos, y la de TET2 solo se expresa moderadamente, la variante TET3, TET3o, muestra niveles extremadamente altos de expresión en ovocitos y cigotos, pero está casi ausente en la etapa de dos células. Es posible que la TET3o, presente en gran cantidad en neuronas, ovocitos y cigotos en la etapa de una célula, sea la principal enzima TET utilizada cuando se producen desmetilaciones rápidas a gran escala en estas células.
Las enzimas TET no se unen específicamente a la 5-metilcitosina , excepto cuando son reclutadas. Sin reclutamiento ni orientación, TET1 se une predominantemente a promotores de CG altos e islas CpG (CGI) en todo el genoma mediante su dominio CXXC que puede reconocer CGI no metiladas . [15] TET2 no tiene afinidad por la 5-metilcitosina en el ADN. [16] El dominio CXXC de la TET3 de longitud completa, que es la forma predominante expresada en las neuronas, se une con mayor fuerza a las CpG donde la C se convirtió en 5-carboxicitosina (5caC). Sin embargo, también se une a las CpG no metiladas . [14]
Para que una enzima TET inicie la desmetilación, primero debe ser reclutada a un sitio CpG metilado en el ADN. Dos de las proteínas que han demostrado reclutar una enzima TET a una citosina metilada en el ADN son OGG1 (ver figura Inicio de la desmetilación del ADN) [17] y EGR1 . [18]
La oxoguanina glicosilasa (OGG1) cataliza el primer paso en la reparación por escisión de bases de la base 8-OHdG dañada oxidativamente . OGG1 encuentra 8-OHdG deslizándose a lo largo del ADN lineal a 1000 pares de bases de ADN en 0,1 segundos. [19] OGG1 encuentra 8-OHdG muy rápidamente. Las proteínas OGG1 se unen al ADN dañado oxidativamente con un tiempo máximo medio de aproximadamente 6 segundos. [20] Cuando OGG1 encuentra 8-OHdG, cambia de conformación y forma complejos con 8-OHdG en el bolsillo de unión de OGG1. [21] OGG1 no actúa inmediatamente para eliminar el 8-OHdG. La eliminación máxima de la mitad de 8-OHdG lleva aproximadamente 30 minutos en células HeLa in vitro , [22] o aproximadamente 11 minutos en los hígados de ratones irradiados . [23] La oxidación del ADN por especies reactivas de oxígeno ocurre preferentemente en una guanina en un sitio CpG metilado, debido a un potencial de ionización reducido de las bases de guanina adyacentes a la 5-metilcitosina. [24] TET1 se une (es reclutado) a la OGG1 unida a 8-OHdG (ver figura). [17] Esto probablemente permite que TET1 desmetile una citosina metilada adyacente. Cuando las células epiteliales mamarias humanas (MCF-10A) fueron tratadas con H 2 O 2 , el 8-OHdG aumentó en el ADN en 3,5 veces y esto causó una desmetilación a gran escala de 5-metilcitosina a aproximadamente el 20% de su nivel inicial en el ADN. [17]
El gen proteína 1 de respuesta al crecimiento temprano ( EGR1 ) es un gen temprano inmediato (IEG). La característica definitoria de los IEG es la rápida y transitoria regulación positiva (en cuestión de minutos) de sus niveles de ARNm independientemente de la síntesis de proteínas. [25] El EGR1 puede ser inducido rápidamente por la actividad neuronal. [26] En la edad adulta, el EGR1 se expresa ampliamente en todo el cerebro, manteniendo niveles de expresión basales en varias áreas clave del cerebro, incluida la corteza prefrontal medial , el cuerpo estriado , el hipocampo y la amígdala . [25] Esta expresión está vinculada al control de la cognición, la respuesta emocional, el comportamiento social y la sensibilidad a la recompensa. [25] El EGR1 se une al ADN en sitios con los motivos 5′-GCGTGGGCG-3′ y 5'-GCGGGGGCGG-3′ y estos motivos ocurren principalmente en las regiones promotoras de los genes. [26] La isoforma corta TET1s se expresa en el cerebro. EGR1 y TET1s forman un complejo mediado por las regiones C-terminales de ambas proteínas, independientemente de la asociación con el ADN. [26] EGR1 recluta a TET1s a las regiones genómicas que flanquean los sitios de unión de EGR1. [26] En presencia de EGR1, TET1s es capaz de realizar una desmetilación específica del locus y la activación de la expresión de genes posteriores regulados por EGR1. [26]
La primera persona en demostrar con éxito la reprogramación fue John Gurdon , quien en 1962 demostró que las células somáticas diferenciadas podían reprogramarse de nuevo a un estado embrionario cuando logró obtener renacuajos nadadores tras la transferencia de células epiteliales intestinales diferenciadas a huevos de rana enucleados. [27] Por este logro recibió el Premio Nobel de Medicina de 2012 junto con Shinya Yamanaka . [28] Yamanaka fue el primero en demostrar (en 2006) que este proceso de transferencia nuclear de células somáticas o reprogramación basada en ovocitos (véase más adelante), que descubrió Gurdon, podía recapitularse (en ratones) mediante factores definidos ( Oct4 , Sox2 , Klf4 y c-Myc ) para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSC). [29] También se han utilizado otras combinaciones de genes, como LIN25 [30] y la proteína Homeobox NANOG . [30] [31]
Con el descubrimiento de que el destino celular podía alterarse, la cuestión de qué progresión de eventos ocurre significa que una célula está experimentando una reprogramación. Como el producto final de la reprogramación de iPSC era similar en morfología , proliferación, expresión genética , pluripotencia y actividad de la telomerasa , se utilizaron marcadores genéticos y morfológicos como una forma de determinar qué fase de la reprogramación estaba ocurriendo. [32] La reprogramación se define en tres fases: iniciación, maduración y estabilización. [33]
La fase de iniciación está asociada con la regulación negativa de genes específicos del tipo celular y la regulación positiva de genes pluripotentes. [33] A medida que las células avanzan hacia la pluripotencia, la actividad de la telomerasa se reactiva para extender los telómeros . La morfología celular puede afectar directamente el proceso de reprogramación a medida que la célula se modifica para prepararse para la expresión génica de la pluripotencia. [34] El principal indicador de que la fase de iniciación se ha completado es que se expresan los primeros genes asociados con la pluripotencia. Esto incluye la expresión de Oct-4 o la proteína Homeobox NANOG , mientras se experimenta una transición mesenquimal-epitelial (MET), y la pérdida de apoptosis y senescencia . [35]
Si la célula se reprograma directamente de una célula somática a otra, los genes asociados con cada tipo de célula comienzan a regularse positiva o negativamente en consecuencia. [33] Esto puede ocurrir a través de la reprogramación celular directa o creando un intermediario, como una iPSC, y diferenciándose en el tipo de célula deseado. [35]
La fase de iniciación se completa a través de una de tres vías: transferencia nuclear , fusión celular o factores definidos ( microARN , factor de transcripción , marcadores epigenéticos y otras moléculas pequeñas). [30] [35]
Un ovocito puede reprogramar un núcleo adulto a un estado embrionario después de la transferencia nuclear de una célula somática , de modo que se pueda desarrollar un nuevo organismo a partir de dicha célula. [36]
La reprogramación es distinta del desarrollo de un epitipo somático , [37] ya que los epitipos somáticos pueden potencialmente alterarse después de que un organismo haya abandonado la etapa de desarrollo de la vida. [38] Durante la transferencia nuclear de células somáticas, el ovocito desactiva los genes específicos del tejido en el núcleo de la célula somática y vuelve a activar los genes específicos embrionarios. Este proceso se ha demostrado a través de la clonación, como se vio a través de John Gurdon con los renacuajos [27] y la oveja Dolly . [39] Cabe destacar que estos eventos han demostrado que el destino celular es un proceso reversible.
[35] La fusión celular se utiliza para crear una célula multinucleada llamada heterocarionte . [35] Las células fusionadas permiten que genes que de otro modo estarían silenciados se reactiven y se expresen. A medida que se reactivan los genes, las células pueden volver a diferenciarse. Hay casos en los que los factores de transcripción, como los factores de Yamanaka, siguen siendo necesarios para ayudar en la reprogramación de células heterocariontes . [40]
A diferencia de la transferencia nuclear y la fusión celular, los factores definidos no requieren un genoma completo, solo factores de reprogramación. Estos factores de reprogramación incluyen microARN , factor de transcripción , marcadores epigenéticos y otras moléculas pequeñas. [35] Los factores de transcripción originales, que conducen al desarrollo de iPSC, descubiertos por Yamanaka incluyen Oct4 , Sox2 , Klf4 y c-Myc (factores OSKM). [29] [32] Aunque se ha demostrado que los factores OSKM inducen y ayudan en la pluripotencia, otros factores de transcripción como la proteína Homeobox NANOG , [41] LIN25, [30] TRA-1-60, [41] y C/EBPα [42] ayudan en la eficiencia de la reprogramación. El uso de microARN y otros procesos impulsados por moléculas pequeñas se ha utilizado como un medio para aumentar la eficiencia de la diferenciación de células somáticas a pluripotencia. [35]
La fase de maduración comienza al final de la fase de iniciación, cuando se expresan los primeros genes pluripotentes. [33] La célula se está preparando para ser independiente de los factores definidos, que iniciaron el proceso de reprogramación. Los primeros genes que se detectan en las iPSC son Oct4 , la proteína Homeobox NANOG y Esrrb, seguidos más tarde por Sox2 . [35] En las últimas etapas de la maduración, el silenciamiento del transgén marca el inicio de la independencia de la célula del factor de transcripción inducido . Una vez que la célula es independiente, la fase de maduración termina y comienza la fase de estabilización.
Como la eficiencia de la reprogramación ha demostrado ser un proceso variable y de baja eficiencia, no todas las células completan la fase de maduración y alcanzan la pluripotencia . [42] Algunas células que se someten a reprogramación aún permanecen bajo apoptosis al comienzo de la etapa de maduración debido al estrés oxidativo provocado por el estrés del cambio de expresión genética. El uso de microARN , proteínas y diferentes combinaciones de los factores OSKM han comenzado a conducir hacia una mayor tasa de eficiencia de reprogramación.
La fase de estabilización se refiere a los procesos en la célula que ocurren después de que la célula alcanza la pluripotencia . Un marcador genético es la expresión de Sox2 y la reactivación del cromosoma X , mientras que los cambios epigenéticos incluyen la telomerasa que extiende los telómeros [30] y la pérdida de la memoria epigenética de la célula. [33] La memoria epigenética de una célula se restablece mediante los cambios en la metilación del ADN, [43] utilizando la citidina desaminasa inducida por activación (AID), las enzimas TET (TET) y la ADN metiltransferasa (DMNT), comenzando en la fase de maduración y en la etapa de estabilización. [33] Una vez que se pierde la memoria epigenética de la célula, se logra la posibilidad de diferenciación en las tres capas germinales. [32] Esto se considera una célula completamente reprogramada, ya que se puede pasar sin volver a su tipo de célula somática original. [35]
La reprogramación también puede inducirse artificialmente mediante la introducción de factores exógenos, generalmente factores de transcripción . En este contexto, a menudo se refiere a la creación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células maduras como fibroblastos adultos . Esto permite la producción de células madre para investigación biomédica , como la investigación en terapias con células madre , sin el uso de embriones. Se lleva a cabo mediante la transfección de genes asociados a células madre en células maduras utilizando vectores virales como los retrovirus .
Uno de los primeros factores transaccionales que se descubrió que modificaban una célula se encontró en un mioblasto cuando se expresó el ADN complementario (ADNc) que codificaba MyoD y convirtió un fibroblasto en un mioblasto. Otro factor transaccional que transformó directamente una célula linfoide en una célula mieloide fue C/EBPα. MyoD y C/EBPα son ejemplos de un pequeño número de factores individuales que pueden transformar células. Más a menudo, una combinación de factores de transcripción trabaja en conjunto para reprogramar una célula.
Los factores OSKM ( Oct4 , Sox2 , Klf4 y c-Myc ) fueron descubiertos inicialmente por Yamanaka en 2006, mediante la inducción de un fibroblasto de ratón en una célula madre pluripotente inducida (iPSC). [29] Durante el año siguiente, estos factores se utilizaron para inducir fibroblastos humanos en iPSC. [32]
Oct4 es parte de los genes reguladores básicos necesarios para la pluripotencia, como se observa tanto en células madre embrionarias como en tumores. [44] El uso de Oct4 incluso en pequeños incrementos permite la diferenciación inicial hacia la pluripotencia. Oct4 trabaja en conjetura con Sox2 para la expresión de FGF4, lo que podría ayudar en la diferenciación.
Sox2 es un gen utilizado para mantener la pluripotencia en las células madre. Oct4 y Sox2 trabajan juntos para regular cientos de genes utilizados en la pluripotencia. [44] Sin embargo, Sox2 no es el único miembro posible de la familia Sox que participa en la regulación genética con Oct4: Sox4 , Sox11 y Sox15 también participan, ya que la proteína Sox es redundante en todo el genoma de la célula madre .
Klf4 es un factor de transcripción que se utiliza en la proliferación , diferenciación , apoptosis y reprogramación de células somáticas . Cuando se utiliza en la reprogramación celular, Klf4 evita la división celular de las células dañadas utilizando su capacidad apoptótica y ayuda en la actividad de la histona acetiltransferasa . [32]
c-Myc también se conoce como oncogén y en ciertas condiciones puede causar cáncer. [45] En la reprogramación celular, c-Myc se utiliza para la progresión del ciclo celular , la apoptosis y la transformación celular para una mayor diferenciación.
La proteína homeobox NANOG (NANOG) es un factor de transcripción utilizado para ayudar en la eficiencia de la generación de iPSC al mantener la pluripotencia [46] y suprimir los factores de determinación celular . [47] NANOG funciona promoviendo la accesibilidad de la cromatina a través de la represión de marcadores de histonas , como H3K27me3 . NANOG ayuda al reclutamiento de Oct4 , Sox2 y Esrrb utilizados en la transcripción , mientras que también recluta el gen 1 relacionado con Brahma (BRG1) para la accesibilidad de la cromatina .
El CEBPA es un factor que se utiliza con frecuencia en la reprogramación de células para convertirlas no solo en iPSC, sino también en otras células. Se ha demostrado que C/EBPα es un factor de transacción único durante la reprogramación directa de una célula linfoide en una célula mieloide. [42] Se considera que C/EBPα es un "innovador" que ayuda a preparar la célula para la absorción de los factores OSKM y los eventos de transcripción específicos. [41] También se ha demostrado que C/EBPα aumenta la eficiencia de los eventos de reprogramación. [33]
Las propiedades de las células obtenidas después de la reprogramación pueden variar significativamente, en particular entre las iPSC. [48] Los factores que conducen a la variación en el rendimiento de la reprogramación y las características funcionales de los productos finales incluyen los antecedentes genéticos, la fuente de tejido, la estequiometría del factor de reprogramación y los factores estresantes relacionados con el cultivo celular. [48]