Las enzimas TET son una familia de metilcitosina dioxigenasas de translocación diez-once (TET). Son fundamentales en la desmetilación del ADN . La 5-metilcitosina (ver la primera figura) es una forma metilada de la base del ADN citosina (C) que a menudo regula la transcripción génica y tiene varias otras funciones en el genoma. [1]
La desmetilación por enzimas TET (ver segunda figura) puede alterar la regulación de la transcripción. Las enzimas TET catalizan la hidroxilación de la 5-metilcitosina (5mC) del ADN a 5-hidroximetilcitosina (5hmC), y pueden catalizar además la oxidación de 5hmC a 5-formilcitosina (5fC) y luego a 5-carboxicitosina (5caC). [2] La 5fC y la 5caC pueden eliminarse de la secuencia de bases del ADN mediante la reparación por escisión de bases y reemplazarse por citosina en la secuencia de bases.
Las enzimas TET tienen un papel central en la desmetilación del ADN necesaria durante la embriogénesis, la gametogénesis, la memoria, el aprendizaje , la adicción y la percepción del dolor . [3]
Los tres genes TET relacionados, TET1 , TET2 y TET3, codifican respectivamente tres proteínas mamíferas relacionadas, TET1, TET2 y TET3. Las tres proteínas poseen actividad oxidasa de 5mC, pero difieren en términos de arquitectura de dominio. [4] Las proteínas TET son enzimas multidominio grandes (~180 a 230 kDa). Todas las proteínas TET contienen un dominio de hélice β de doble cadena (DSBH) conservado, un dominio rico en cisteína y sitios de unión para los cofactores Fe(II) y 2-oxoglutarato (2-OG) que juntos forman la región catalítica central en el extremo C. Además de su dominio catalítico , las proteínas TET1 y TET3 de longitud completa tienen un dominio de dedo de zinc CXXC N-terminal que puede unirse al ADN. [5] La proteína TET2 carece de un dominio CXXC, pero el gen IDAX , vecino del gen TET2, codifica una proteína CXXC4. Se cree que IDAX desempeña un papel en la regulación de la actividad de TET2 al facilitar su reclutamiento a CpG no metilados.
Los tres genes TET se expresan como isoformas diferentes , incluidas al menos dos isoformas de TET1, tres de TET2 y tres de TET3. [2] [6] Diferentes isoformas de los genes TET se expresan en diferentes células y tejidos. La isoforma canónica TET1 de longitud completa parece estar prácticamente restringida a embriones tempranos, células madre embrionarias y células germinales primordiales (PGC). La isoforma TET1 dominante en la mayoría de los tejidos somáticos, al menos en el ratón, surge del uso de promotores alternativos que dan lugar a una transcripción corta y una proteína truncada designada TET1s. Las tres isoformas de TET2 surgen de diferentes promotores. Se expresan y son activas en la embriogénesis y la diferenciación de células hematopoyéticas . Las isoformas de TET3 son la forma de longitud completa TET3FL, una variante de empalme de forma corta TET3s y una forma que se presenta en ovocitos designada TET3o. TET3o se crea mediante el uso de un promotor alternativo y contiene un primer exón N-terminal adicional que codifica 11 aminoácidos. TET3o solo se produce en ovocitos y en la etapa unicelular del cigoto y no se expresa en células madre embrionarias ni en ningún otro tipo de célula o tejido de ratón adulto analizado. Mientras que la expresión de TET1 apenas se puede detectar en ovocitos y cigotos, y TET2 solo se expresa moderadamente, la variante TET3 TET3o muestra niveles extremadamente altos de expresión en ovocitos y cigotos, pero está casi ausente en la etapa de 2 células. Parece que TET3o, alta en ovocitos y cigotos en la etapa unicelular, es la principal enzima TET utilizada cuando se produce una desmetilación rápida de casi el 100% en el genoma paterno justo después de la fertilización y antes de que comience la replicación del ADN (consulte Desmetilación del ADN ).
Muchas proteínas diferentes se unen a enzimas TET particulares y reclutan a las TET a ubicaciones genómicas específicas. En algunos estudios, se necesitan más análisis para determinar si la interacción per se media el reclutamiento o, en cambio, el compañero interactuante ayuda a establecer un entorno de cromatina favorable para la unión de TET. Las células con TET1 y TET2 deficientes revelaron preferencias de diana distintas para estas dos enzimas, con promotores que preferían TET1 y cuerpos génicos que preferían TET2 de genes y potenciadores altamente expresados. [7]
Las tres metiltransferasas de ADN de mamíferos (DNMT) muestran una fuerte preferencia por añadir un grupo metilo al carbono 5 de una citosina , donde un nucleótido de citosina es seguido por un nucleótido de guanina en la secuencia lineal de bases a lo largo de su dirección 5' → 3' (en los sitios CpG ). [8] Esto forma un sitio 5mCpG. Más del 98% de la metilación del ADN ocurre en sitios CpG en células somáticas de mamíferos . [9] Por lo tanto, las enzimas TET inician en gran medida la desmetilación en los sitios 5mCpG.
La oxoguanina glicosilasa (OGG1) es un ejemplo de una proteína que recluta una enzima TET. TET1 es capaz de actuar sobre 5mCpG si una ROS ha actuado primero sobre la guanina para formar 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG o su tautómero 8-oxo-dG), lo que da como resultado un dinucleótido 5mCp-8-OHdG (ver Figura). [10] Después de la formación de 5mCp-8-OHdG, la enzima de reparación por escisión de bases OGG1 se une a la lesión de 8-OHdG sin escisión inmediata (ver Figura). La adherencia de OGG1 al sitio 5mCp-8-OHdG recluta a TET1 , lo que permite que TET1 oxide el 5mC adyacente a 8-OHdG. Esto inicia la vía de desmetilación.
EGR1 es otro ejemplo de una proteína que recluta una enzima TET. [11] EGR1 tiene un papel importante en el aprendizaje y la memoria. [12] [13] Cuando un nuevo evento como el condicionamiento del miedo hace que se forme un recuerdo, el ARN mensajero EGR1 se regula al alza de forma rápida y selectiva en subconjuntos de neuronas en regiones cerebrales específicas asociadas con el aprendizaje y la formación de la memoria. [14] TET1s es la isoforma predominante de TET1 que se expresa en las neuronas. [15] Cuando se expresan las proteínas EGR1, parecen llevar a TET1s a unos 600 sitios en el genoma de la neurona. [11] Luego, EGR1 y TET1 parecen cooperar en la desmetilación y, por lo tanto, activando la expresión de genes aguas abajo de los sitios de unión de EGR1 en el ADN. [11]
La procesividad de la TET puede considerarse en tres niveles: físico, químico y genético. La procesividad física se refiere a la capacidad de una proteína TET de deslizarse a lo largo del ADN desde un sitio CpG a otro. Un estudio in vitro mostró que la TET unida al ADN no oxida preferentemente otros sitios CpG en la misma molécula de ADN, lo que indica que la TET no es físicamente procesiva. La procesividad química se refiere a la capacidad de la TET de catalizar la oxidación de 5mC de forma iterativa a 5caC sin liberar su sustrato. Parece que la TET puede funcionar a través de mecanismos tanto químicamente procesivos como no procesivos según las condiciones de reacción. La procesividad genética se refiere al resultado genético de la oxidación mediada por la TET en el genoma, como se muestra mediante el mapeo de las bases oxidadas. En las células madre embrionarias de ratón, muchas regiones genómicas o sitios CpG se modifican de modo que 5mC se cambia a 5hmC pero no a 5fC o 5caC, mientras que en muchos otros sitios CpG los 5mC se modifican a 5fC o 5caC pero no a 5hmC, lo que sugiere que 5mC se procesa a diferentes estados en diferentes regiones genómicas o sitios CpG. [7]
Las enzimas TET son dioxigenasas de la familia de las hidroxilasas dependientes de alfa-cetoglutarato . Una enzima TET es una dioxigenasa dependiente de alfa-cetoglutarato (α-KG) que cataliza una reacción de oxidación incorporando un solo átomo de oxígeno del oxígeno molecular (O 2 ) en su sustrato, 5-metilcitosina en el ADN (5mC), para producir el producto 5-hidroximetilcitosina en el ADN. Esta conversión está acoplada con la oxidación del cosustrato α-KG a succinato y dióxido de carbono (ver Figura).
El primer paso implica la unión de α-KG y 5-metilcitosina al sitio activo de la enzima TET. Cada enzima TET alberga un dominio catalítico central con un pliegue de hélice β de doble cadena que contiene los residuos cruciales de unión a metales que se encuentran en la familia de oxigenasas dependientes de Fe(II)/α-KG. [16] α-KG se coordina como un ligando bidentado (conectado en dos puntos) a Fe(II) (ver Figura), mientras que el 5mC está retenido por una fuerza no covalente en estrecha proximidad. El sitio activo de TET contiene un motivo de tríada altamente conservado, en el que el Fe(II) catalíticamente esencial está retenido por dos residuos de histidina y un residuo de ácido aspártico (ver Figura). La tríada se une a una cara del centro de Fe, dejando tres sitios lábiles disponibles para la unión de α-KG y O2 ( ver Figura). Luego, la TET actúa para convertir la 5-metilcitosina en 5-hidroximetilcitosina, mientras que el α-cetoglutarato se convierte en succinato y CO 2 .
Las proteínas TET también tienen actividades que son independientes de la desmetilación del ADN. [17] Estas incluyen, por ejemplo, la interacción de TET2 con la transferasa de N -acetilglucosamina ligada a O ( O-GlcNAc ) para promover la acilación de la histona O-GlcN y afectar la transcripción de genes objetivo. [18]
El genoma del esperma del ratón está metilado en un 80-90% en sus sitios CpG en el ADN, lo que suma alrededor de 20 millones de sitios metilados. [19] Después de la fertilización , a principios del primer día de embriogénesis , los cromosomas paternos se desmetilan casi por completo en seis horas mediante un proceso activo dependiente de TET, antes de que comience la replicación del ADN (línea azul en la Figura).
La desmetilación del genoma materno ocurre por un proceso diferente. En el ovocito maduro , aproximadamente el 40% de sus sitios CpG en el ADN están metilados. En el embrión de preimplantación hasta la etapa de blastocisto (ver Figura), la única metiltransferasa presente es una isoforma de DNMT1 denominada DNMT1o. [20] Parece que la desmetilación de los cromosomas maternos ocurre en gran parte por el bloqueo de la enzima metilante DNMT1o para que no entre al núcleo, excepto brevemente en la etapa de 8 células (ver Desmetilación del ADN ). El ADN de origen materno sufre así una desmetilación pasiva por dilución del ADN materno metilado durante la replicación (línea roja en la Figura). La mórula (en la etapa de 16 células), tiene solo una pequeña cantidad de metilación del ADN (línea negra en la Figura).
Las células germinales primordiales (PGC) recién formadas en el embrión implantado se desdoblan a partir de las células somáticas aproximadamente en el día 7 de la embriogénesis en el ratón. En este punto, las PGC tienen altos niveles de metilación. Estas células migran desde el epiblasto hacia la cresta gonadal . Como revisaron Messerschmidt et al., [21] la mayoría de las PGC se detienen en la fase G 2 del ciclo celular mientras migran hacia el intestino posterior durante los días embrionarios 7.5 a 8.5. Luego, la desmetilación de las PGC tiene lugar en dos oleadas. [21] Hay una desmetilación tanto pasiva como activa, dependiente de TET, de las células germinales primordiales. En el día 9.5, las células germinales primordiales comienzan a replicarse rápidamente, pasando de aproximadamente 200 PGC en el día embrionario 9.5 a aproximadamente 10,000 PGC en el día 12.5. [22] Durante los días 9,5 a 12,5, DNMT3a y DNMT3b se reprimen y DNMT1 está presente en el núcleo en un nivel alto. Pero DNMT1 no puede metilar citosinas durante los días 9,5 a 12,5 porque el gen UHRF1 (también conocido como NP95 ) está reprimido y UHRF1 es una proteína esencial necesaria para reclutar DNMT1 a los focos de replicación donde se lleva a cabo la metilación de mantenimiento del ADN. [22] Esta es una forma pasiva de dilución de desmetilación.
Además, desde el día 9,5 hasta el 13,5 del embrión hay una forma activa de desmetilación. Como se indica en la figura de la vía de desmetilación anterior, dos enzimas son fundamentales para la desmetilación activa. Se trata de una metilcitosina dioxigenasa de translocación diez-once (TET) y una timina-ADN glicosilasa (TDG). Una enzima TET en particular, TET1, y TDG están presentes en altos niveles desde el día 9,5 hasta el 13,5 del embrión, [22] y se emplean en la desmetilación activa dependiente de TET durante la gametogénesis. [21] Los genomas de PGC muestran los niveles más bajos de metilación del ADN de todas las células en todo el ciclo de vida del ratón en el día 13,5 del embrión. [23]
El aprendizaje y la memoria tienen niveles de permanencia, a diferencia de otros procesos mentales como el pensamiento, el lenguaje y la conciencia, que son de naturaleza temporal. El aprendizaje y la memoria pueden acumularse de forma lenta (tablas de multiplicar) o rápida (tocar una estufa caliente), pero una vez alcanzados, pueden recuperarse para un uso consciente durante mucho tiempo. Las ratas sometidas a una instancia de condicionamiento del miedo contextual crean una memoria a largo plazo especialmente fuerte. A las 24 horas después del entrenamiento, se encontró que el 9,17% de los genes en los genomas de las neuronas del hipocampo de la rata estaban metilados de forma diferencial . Esto incluía más de 2000 genes metilados de forma diferencial a las 24 horas después del entrenamiento, con más de 500 genes desmetilados. [24] También se obtuvieron resultados similares a los del hipocampo de la rata en ratones con condicionamiento del miedo contextual. [25]
La región del hipocampo del cerebro es donde se almacenan por primera vez los recuerdos de miedo contextual (véase la Figura), pero este almacenamiento es transitorio y no permanece en el hipocampo. En ratas, el condicionamiento de miedo contextual se elimina cuando el hipocampo se somete a una hipocampectomía solo un día después del condicionamiento, pero las ratas retienen una cantidad considerable de miedo contextual cuando la hipocampectomía se retrasa cuatro semanas. [26] En ratones, examinados a las 4 semanas después del condicionamiento, las metilaciones y desmetilaciones del hipocampo se invirtieron (el hipocampo es necesario para formar recuerdos, pero los recuerdos no se almacenan allí), mientras que se produjo una metilación y desmetilación de CpG diferencial sustancial en las neuronas corticales durante el mantenimiento de la memoria. Hubo 1.223 genes metilados diferencialmente en la corteza cingulada anterior (véase la Figura) de ratones cuatro semanas después del condicionamiento de miedo contextual. Por lo tanto, si bien hubo muchas metilaciones en el hipocampo poco después de que se formara la memoria, todas estas metilaciones del hipocampo se desmetilaron tan pronto como cuatro semanas después.
Li et al. [27] informaron un ejemplo de la relación entre la expresión de una proteína TET, la desmetilación y la memoria durante el uso del entrenamiento de extinción . El entrenamiento de extinción es la desaparición de una conducta previamente aprendida cuando dicha conducta no se refuerza.
Una comparación entre muestras de neuronas de la corteza prefrontal infralímbica (CPIIL) derivadas de ratones entrenados para temer una señal auditiva y ratones entrenados para la extinción reveló diferencias dramáticas en todo el genoma, dependientes de la experiencia, en la acumulación de 5-hmC en la CPIIL en respuesta al aprendizaje. El entrenamiento para la extinción condujo a un aumento significativo en los niveles de ARN mensajero TET3 dentro de las neuronas corticales. TET3 se activó selectivamente dentro del neocórtex adulto de una manera dependiente de la experiencia.
Un ARN de horquilla corta (shRNA) es una molécula de ARN artificial con una curva de horquilla cerrada que se puede utilizar para silenciar la expresión de un gen objetivo mediante interferencia de ARN . Los ratones entrenados en presencia de shRNA dirigido a TET3 mostraron un deterioro significativo en la memoria de extinción del miedo. [27]
El núcleo accumbens (NAc) tiene un papel importante en la adicción . En el núcleo accumbens de ratones, la exposición repetida a la cocaína resultó en una reducción del ARN mensajero (ARNm) de TET1 y una reducción de la expresión de la proteína TET1. De manera similar, hubo una disminución de aproximadamente el 40% del ARNm de TET1 en el NAc de adictos a la cocaína humanos examinados post mortem. [28]
Como se indicó anteriormente en el aprendizaje y la memoria, un ARN de horquilla corta (shRNA) es una molécula de ARN artificial con una curva de horquilla apretada que se puede utilizar para silenciar la expresión del gen objetivo a través de la interferencia del ARN . Feng et al. [28] inyectaron shRNA dirigido a TET1 en el NAc de ratones. Esto podría reducir la expresión de TET1 de la misma manera que la reducción de la expresión de TET1 con la exposición a la cocaína. Luego utilizaron una medida indirecta de la adicción, la preferencia de lugar condicionada . La preferencia de lugar condicionada puede medir la cantidad de tiempo que un animal pasa en un área que se ha asociado con la exposición a la cocaína, y esto puede indicar una adicción a la cocaína. La expresión reducida de Tet1 causada por shRNA inyectado en el NAc mejoró robustamente el condicionamiento del lugar de la cocaína.
Como se describe en el artículo Nocicepción , la nocicepción es la respuesta del sistema nervioso sensorial a estímulos dañinos, como una sustancia química tóxica aplicada a un tejido. En la nocicepción, la estimulación química de las células nerviosas sensoriales llamadas nociceptores produce una señal que viaja a lo largo de una cadena de fibras nerviosas a través de la médula espinal hasta el cerebro . La nocicepción desencadena una variedad de respuestas fisiológicas y conductuales y, por lo general, da como resultado una experiencia subjetiva, o percepción , de dolor .
El trabajo de Pan et al. [3] fue el primero en demostrar que las proteínas TET1 y TET3 están presentes normalmente en la médula espinal de ratones. Utilizaron un modelo de inducción de dolor de inyección intraplantar de formalina al 5% en la superficie dorsal de la pata trasera del ratón y midieron el tiempo de lamido de la pata trasera como una medida del dolor inducido. La expresión de proteínas de TET1 y TET3 aumentó en un 152% y 160%, respectivamente, a las 2 horas después de la inyección de formalina. La reducción forzada de la expresión de TET1 o TET3 por inyección espinal de Tet1-siRNA o Tet3-siRNA durante tres días consecutivos antes de la inyección de formalina alivió la percepción del dolor del ratón. Por otro lado, la sobreexpresión forzada de TET1 o TET3 durante 2 días consecutivos produjo significativamente un comportamiento similar al dolor como lo demuestra una disminución en el umbral de dolor térmico del ratón.
Además, demostraron que los efectos del dolor nociceptivo se produjeron a través de la conversión mediada por TET de 5-metilcitosina a 5-hidroximetilcitosina en el promotor de un microARN denominado miR-365-3p , aumentando así su expresión. Este microARN, a su vez, normalmente se dirige a (disminuye la expresión de) el ARN mensajero de Kcnh2 , que codifica una proteína conocida como K v 11.1 o KCNH2. KCNH2 es la subunidad alfa de un canal de iones de potasio en el sistema nervioso central . La disminución forzada de la expresión de TET1 o TET3 a través de la preinyección de ARNi revirtió la disminución de la proteína KCNH2 en ratones tratados con formalina.