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Canalrodopsina

Las canalrodopsinas son una subfamilia de proteínas de retinilideno ( rodopsinas ) que funcionan como canales iónicos controlados por luz . [1] Actúan como fotorreceptores sensoriales en algas verdes unicelulares , controlando la fototaxis : movimiento en respuesta a la luz. [2] Expresadas en células de otros organismos, permiten que la luz controle la excitabilidad eléctrica , la acidez intracelular , el influjo de calcio y otros procesos celulares (ver optogenética ). La canalrodopsina-1 (ChR1) y la canalrodopsina-2 (ChR2) del organismo modelo Chlamydomonas reinhardtii son las primeras canalrodopsinas descubiertas. Las variantes que son sensibles a diferentes colores de luz o selectivas para iones específicos (ACR, KCR) se han clonado a partir de otras especies de algas y protistas .

Historia

La fototaxis y la fotoorientación de las microalgas se han estudiado durante más de cien años en muchos laboratorios de todo el mundo. En 1980, Ken Foster desarrolló la primera teoría consistente sobre la funcionalidad de los ojos de las algas. [3] También analizó los espectros de acción publicados y complementó las células ciegas con retinal y análogos de retinal, lo que llevó a la conclusión de que el fotorreceptor para las respuestas de motilidad en Chlorophyceae es la rodopsina . [4]

Las fotocorrientes de las clorofíceas Haematococcus pluvialis y Chlamydomonas reinhardtii fueron estudiadas durante muchos años en los grupos de Oleg Sineshchekov y Peter Hegemann . [5] [6] Basándose en la espectroscopia de acción y en registros simultáneos de fotocorrientes y de batido flagelar, se determinó que las corrientes de los fotorreceptores y los movimientos flagelares subsiguientes están mediados por la rodopsina y controlan la fototaxis y las respuestas fotofóbicas. El aumento extremadamente rápido de la corriente de los fotorreceptores después de un breve destello de luz condujo a la conclusión de que la rodopsina y el canal están íntimamente ligados en un complejo proteico, o incluso dentro de una sola proteína. [7] [8]

El nombre "canalrodopsina" fue acuñado para destacar esta propiedad inusual, y las secuencias fueron renombradas en consecuencia. Las secuencias de nucleótidos de las rodopsinas ahora llamadas canalrodopsinas ChR1 y ChR2 fueron finalmente descubiertas en un proyecto de secuenciación EST a gran escala en C. reinhardtii . La presentación independiente de las mismas secuencias a GenBank por parte de tres grupos de investigación generó confusión sobre su denominación: los nombres cop-3 y cop-4 fueron utilizados para la presentación inicial por el grupo de Hegemann; [9] csoA y csoB por el grupo de Spudich; [2] y acop-1 y acop-2 por el grupo de Takahashi. [10] Se descubrió que ambas secuencias funcionaban como canales de cationes activados por luz de un solo componente en ovocitos de Xenopus y células renales humanas (HEK). [1] [11]

Sus funciones en la generación de corrientes fotorreceptoras en células de algas fueron caracterizadas por Oleg Sineshchekov, Kwang-Hwan Jung y John Spudich, [2] y Peter Berthold y Peter Hegemann. [12]

Estructura

Estructura cristalina de la canalrodopsina. PDB 3ug9 [13]

En términos de estructura, las canalrodopsinas son proteínas retinilidén . Son proteínas de siete transmembrana como la rodopsina , y contienen el cromóforo isomerizable a la luz all- trans - retinal (un derivado aldehído de la vitamina A ). El cromóforo retinal está unido covalentemente al resto de la proteína a través de una base de Schiff protonada . Mientras que la mayoría de las proteínas de 7 transmembrana son receptores acoplados a proteína G que abren otros canales iónicos indirectamente a través de segundos mensajeros (es decir, son metabotrópicas ), las canalrodopsinas forman directamente canales iónicos (es decir, son ionotrópicas ). [11] Esto hace que la despolarización celular sea extremadamente rápida, robusta y útil para aplicaciones de bioingeniería y neurociencia, incluida la fotoestimulación .

Función

Esquema de la construcción de la fusión ChR2-RFP

El ChR2 natural ("tipo salvaje") absorbe luz azul con un espectro de absorción y acción máximo a 480 nm. [14] Cuando el complejo todo -trans -retinal absorbe un fotón , induce un cambio conformacional de todo- trans a 13 -cis -retinal. Este cambio introduce otro en la proteína transmembrana, abriendo el poro a al menos 6  Å. En milisegundos, el retinal se relaja de nuevo a la forma todo-trans, cerrando el poro y deteniendo el flujo de iones. [11] La mayoría de las canalrodopsinas naturales son canales de cationes no específicos (CCR), que conducen iones H + , Na + , K + y Ca 2+ . Las canalrodopsinas conductoras de aniones (ACR) [15] y las canalrodopsinas selectivas de potasio (HcKCR1, HcKCR2) [16] se analizaron estructuralmente para comprender su selectividad iónica. [17] [18] Los ACR y los KCR se han utilizado para inhibir la actividad neuronal. Las canalrodopsinas virales (VCR1), descubiertas recientemente, se localizan en la membrana del retículo endoplasmático y provocan la liberación de calcio cuando se iluminan. [19]

El desarrollo como herramienta molecular

En 2005, tres grupos establecieron secuencialmente ChR2 como una herramienta para el control remoto óptico genéticamente dirigido ( optogenética ) de neuronas , circuitos neuronales y comportamiento.

En un primer momento, el laboratorio de Karl Deisseroth demostró que ChR2 podía utilizarse para controlar neuronas de mamíferos in vitro , logrando una precisión temporal del orden de milisegundos (tanto en términos de retraso en la activación como en términos de fluctuación temporal). [20] Debido a que todas las opsinas requieren retinal como cofactor de detección de luz y no estaba claro si las células nerviosas centrales de los mamíferos contendrían niveles suficientes de retinal, pero lo hacen. También mostró, a pesar de la pequeña conductancia de un solo canal, potencia suficiente para impulsar a las neuronas de mamíferos por encima del umbral del potencial de acción. A partir de esto, la canalrodopsina se convirtió en la primera herramienta optogenética, con la que se podía controlar la actividad neuronal con la precisión temporal con la que operan las neuronas (milisegundos). Más tarde se publicó un segundo estudio que confirmaba la capacidad de ChR2 para controlar la actividad de las neuronas de vertebrados , en este momento en la médula espinal del pollo. [21] Este estudio fue el primero en el que se expresó ChR2 junto con un silenciador óptico, en este caso la rodopsina -4 de vertebrados, demostrando por primera vez que las células excitables podían activarse y silenciarse utilizando estas dos herramientas simultáneamente, iluminando el tejido en diferentes longitudes de onda.

Se demostró que ChR2, si se expresa en neuronas o células musculares específicas, puede evocar comportamientos predecibles, es decir, puede controlar el sistema nervioso de un animal intacto, en este caso el invertebrado C. elegans . [22] Este fue el primer uso de ChR2 para dirigir el comportamiento de un animal en un experimento optogenético, haciendo que un tipo de célula genéticamente especificado esté sujeto a control remoto óptico. Aunque ambos aspectos habían sido ilustrados a principios de ese año por el grupo de Gero Miesenböck , desplegando el canal iónico P2X2 controlado indirectamente por luz, [23] a partir de entonces fueron las opsinas microbianas como la canalrodopsina las que dominaron el campo del control remoto genéticamente dirigido de células excitables, debido a la potencia, velocidad, capacidad de orientación, facilidad de uso y precisión temporal de la activación óptica directa, que no requiere ningún compuesto químico externo como ligandos enjaulados. [24]

Para superar sus principales desventajas (la pequeña conductancia de un solo canal (especialmente en estado estable), la limitación a una longitud de onda de excitación óptima (~470  nm, azul) así como el tiempo de recuperación relativamente largo, que no permite la activación controlada de neuronas por encima de 20-40 Hz), se ha optimizado ChR2 mediante ingeniería genética . Una mutación puntual H134R (que intercambia el aminoácido histidina en la posición 134 de la proteína nativa por una arginina) dio como resultado una mayor conductancia en estado estable, como se describe en un artículo de 2005 que también estableció a ChR2 como una herramienta optogenética en C. elegans . [22] En 2009, el laboratorio de Roger Tsien optimizó ChR2 para obtener mayores aumentos en la conductancia en estado estable y redujo drásticamente la desensibilización creando quimeras de ChR1 y ChR2 y mutando aminoácidos específicos, produciendo ChEF y ChIEF, que permitieron la conducción de trenes de potenciales de acción de hasta 100 Hz. [25] [26] En 2010, los grupos de Hegemann y Deisseroth introdujeron una mutación E123T en ChR2 nativo, produciendo ChETA, que tiene una cinética de encendido y apagado más rápida , lo que permite el control de potenciales de acción individuales a frecuencias de hasta 200  Hz (en tipos de células apropiados). [27] [25]

Los grupos de Hegemann y Deisseroth también descubrieron que la introducción de la mutación puntual C128S convierte al derivado de ChR2 resultante en una herramienta de función escalonada: una vez "activado" por la luz azul, ChR2(C128S) permanece en estado abierto hasta que se apaga por la luz amarilla, una modificación que deteriora la precisión temporal, pero aumenta la sensibilidad a la luz en dos órdenes de magnitud. [28] También descubrieron y caracterizaron VChR1 en las algas multicelulares Volvox carteri . VChR1 produce solo fotocorrientes diminutas, pero con un espectro de absorción que está desplazado al rojo en relación con ChR2. [29] Utilizando partes de la secuencia de ChR1, la amplitud de la fotocorriente se mejoró más tarde para permitir la excitación de dos poblaciones neuronales en dos longitudes de onda distintas. [30]

El grupo de Deisseroth ha sido pionero en muchas aplicaciones en animales vivos, como el control remoto genéticamente dirigido en roedores in vivo , [31] la inducción optogenética del aprendizaje en roedores, [32] el tratamiento experimental de la enfermedad de Parkinson en ratas, [33] [34] y la combinación con fMRI (opto-fMRI). [35] Otros laboratorios han sido pioneros en la combinación de la estimulación de ChR2 con imágenes de calcio para experimentos totalmente ópticos, [36] el mapeo de circuitos neuronales de largo alcance [37] y locales [38] , la expresión de ChR2 desde un locus transgénico - directamente [39] o en el paradigma condicional Cre-lox [38] - así como la excitación de dos fotones de ChR2, lo que permite la activación de células individuales. [40] [41] [42]

En marzo de 2013, el Premio Europeo de Investigación Cerebral Grete Lundbeck fue otorgado conjuntamente a Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck y Nagel por "su invención y refinamiento de la optogenética". [43] El mismo año, Hegemann y Nagel recibieron el Premio Louis-Jeantet de Medicina por "el descubrimiento de la canalrodopsina". En 2015, Boyden y Deisseroth recibieron el Premio Breakthrough en Ciencias de la Vida y en 2020, Miesenböck, Hegemann y Nagel recibieron el premio Shaw en Ciencias de la Vida y Medicina por el desarrollo de la optogenética.

Rodopsinas de canal de diseño

Las canalrodopsinas son herramientas clave en optogenética . El extremo C-terminal de la canalrodopsina-2 se extiende hacia el espacio intracelular y puede ser reemplazado por proteínas fluorescentes sin afectar la función del canal. Este tipo de construcción de fusión puede ser útil para visualizar la morfología de las células que expresan ChR2, es decir, indicar simultáneamente qué células están marcadas con FP y permitir que la actividad sea controlada por la canalrodopsina. [20] [36] Se ha demostrado que las mutaciones puntuales cercanas al bolsillo de unión de la retina afectan las propiedades biofísicas de la canalrodopsina, lo que da como resultado una variedad de herramientas diferentes.

Cinética

El cierre del canal después de la activación óptica se puede retrasar sustancialmente mutando los residuos proteicos C128 o D156. Esta modificación da como resultado canalrodopsinas supersensibles que se pueden abrir con un pulso de luz azul y cerrar con un pulso de luz verde o amarilla (opsinas de función escalonada). [28] [44] [30] La mutación del residuo E123 acelera la cinética del canal (ChETA), y los mutantes ChR2 resultantes se han utilizado para activar neuronas a hasta 200 Hz. [27] En general, las canalrodopsinas con cinética lenta son más sensibles a la luz a nivel de población, ya que los canales abiertos se acumulan con el tiempo incluso con niveles bajos de luz.

Amplitud de la fotocorriente

Los mutantes H134R y T159C muestran fotocorrientes aumentadas, y una combinación de T159 y E123 (ET/TC) tiene fotocorrientes ligeramente mayores y una cinética ligeramente más rápida que la de ChR2 de tipo salvaje. [45] ChIEF, una quimera y mutante puntual de ChR1 y ChR2, demuestra grandes fotocorrientes, poca desensibilización y una cinética similar a la de ChR2 de tipo salvaje. [25] Las variantes con tiempo abierto extendido (ChR2-XXL) producen fotocorrientes extremadamente grandes y son muy sensibles a la luz a nivel de población. [46]

Longitud de onda

Las canalrodopsinas quiméricas se han desarrollado combinando hélices transmembrana de ChR1 y VChR1, lo que ha dado lugar al desarrollo de ChR con desplazamientos espectrales al rojo (como C1V1 y ReaChR). [30] [47] ReaChR ha mejorado el tráfico de membrana y la expresión fuerte en células de mamíferos, y se ha utilizado para la activación transcraneal mínimamente invasiva de las neuronas motoras del tronco encefálico . Las búsquedas de secuencias homólogas en otros organismos han producido canalrodopsinas con desplazamiento al rojo espectralmente mejorado y más fuerte (Chrimson). [48] En combinación con ChR2, estas canalrodopsinas sensibles a la luz amarilla/roja permiten controlar dos poblaciones de neuronas de forma independiente con pulsos de luz de diferentes colores. [49] [50]

Se ha descubierto una canalrodopsina desplazada hacia el azul en el alga Scherffelia dubia . Después de algunas modificaciones para mejorar el tráfico y la velocidad de la membrana, la herramienta resultante (CheRiff) produjo grandes fotocorrientes a una excitación de 460 nm. [51] Se ha combinado con el indicador de calcio codificado genéticamente jRCaMP1b [52] en un sistema completamente óptico llamado OptoCaMP. [53]

Selectividad iónica

La mayoría de las canalrodopsinas son canales de cationes inespecíficos. Cuando se expresan en neuronas, conducen principalmente iones Na + y, por lo tanto, son despolarizantes (excitadoras). Se han diseñado variantes con permeabilidad al calcio de moderada a alta (CatCh, CapChRs). [54] [55] Las canalrodopsinas específicas de K + (KCRs, WiChR) se descubrieron recientemente en varios protistas . [56] [57] Cuando se expresan en neuronas, las canalrodopsinas selectivas de potasio hiperpolarizan la membrana tras la iluminación, lo que evita la generación de picos (inhibitorias).

La mutación de E90 al aminoácido arginina con carga positiva convierte la canalrodopsina de un canal catiónico inespecífico en un canal conductor de cloruro (ChloC). [58] La selectividad para Cl- se mejoró aún más al reemplazar los residuos con carga negativa en el poro del canal, lo que hace que el potencial de inversión sea más negativo. [59] [60] Las canalrodopsinas conductoras de aniones (iChloC, iC++, Gt ACR) inhiben la activación neuronal en cultivos celulares y en animales intactos cuando se iluminan con luz azul. Las canalrodopsinas selectivas de calcio se han diseñado para activar enzimas dependientes del calcio en las células. [61]

Aplicaciones

Las canalrodopsinas se pueden expresar fácilmente en células excitables como las neuronas utilizando una variedad de técnicas de transfección ( transfección viral , electroporación , pistola genética ) o animales transgénicos . El pigmento que absorbe la luz retinal está presente en la mayoría de las células (de vertebrados ) como vitamina A , lo que hace posible fotoestimular las neuronas sin agregar ningún compuesto químico. Antes del descubrimiento de las canalrodopsinas, los neurocientíficos se limitaban a registrar la actividad de las neuronas en el cerebro y correlacionar esta actividad con el comportamiento. Esto no es suficiente para demostrar que la actividad neuronal registrada realmente causó ese comportamiento. El control de redes de células modificadas genéticamente con luz, un campo emergente conocido como optogenética , permite ahora a los investigadores explorar el vínculo causal entre la actividad en un grupo específico de neuronas y los eventos mentales , por ejemplo, la toma de decisiones . El control óptico del comportamiento se ha demostrado en nematodos, moscas de la fruta, pez cebra y ratones. [62] [63] Recientemente, se han diseñado canalrodopsinas conductoras de cloruro y también se han encontrado en la naturaleza. [15] [58] Estas herramientas se pueden utilizar para silenciar neuronas en cultivos celulares y en animales vivos desviando la inhibición . [59] [60]

El uso de múltiples colores de luz amplía las posibilidades de los experimentos optogenéticos . El ChR2, sensible a la luz azul, y la bomba de cloruro activada por luz amarilla, halorhodopsina, permiten juntos la activación óptica de múltiples colores y el silenciamiento de la actividad neuronal. [64] [65] Otro par interesante es el canal de cloruro sensible a la luz azul Gt ACR2 [66] y el canal de cationes sensible a la luz roja Chrimson [67], que se han combinado en una sola proteína (BiPOLES) para el control bidireccional del potencial de membrana. [68]

Utilizando ChR2 marcado con fluorescencia, se pueden identificar axones y sinapsis estimulados por luz. [36] Esto es útil para estudiar los eventos moleculares durante la inducción de la plasticidad sináptica . [69] [70] Las redes neuronales cultivadas transfectadas se pueden estimular para realizar algunos comportamientos deseados para aplicaciones en robótica y control. [71] ChR2 también se ha utilizado para mapear conexiones de largo alcance de un lado del cerebro al otro, y para mapear la ubicación espacial de las entradas en el árbol dendrítico de neuronas individuales. [37] [72]

En 2006, se informó que la transfección con canalrodopsina podría restaurar la vista a ratones ciegos. [73]

Las neuronas pueden tolerar la expresión de ChR durante mucho tiempo, y varios laboratorios están probando la estimulación optogenética para resolver necesidades médicas. En ratones ciegos, la función visual se puede restaurar parcialmente expresando ChR2 en las células internas de la retina. [74] [75] En 2021, el ChR sensible a la luz roja ChrimsonR se administró viralmente a los ojos de un paciente humano que sufría degeneración de la retina ( retinitis pigmentosa ), lo que provocó una recuperación parcial de su visión. [76] [77] Se ha demostrado que los implantes cocleares ópticos funcionan bien en experimentos con animales y actualmente se encuentran en ensayos clínicos. [78] [79] [80] En el futuro, los ChR pueden encontrar aún más aplicaciones médicas, por ejemplo, para la estimulación cerebral profunda de pacientes con Parkinson o para controlar ciertas formas de epilepsia .

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