La recombinación Cre-Lox es una tecnología de recombinasa de sitio específico , utilizada para llevar a cabo deleciones , inserciones , translocaciones e inversiones en sitios específicos del ADN de las células. Permite que la modificación del ADN se dirija a un tipo de célula específica o se desencadene mediante un estímulo externo específico. Se implementa tanto en sistemas eucariotas como procarióticos. El sistema de recombinación Cre-lox ha sido particularmente útil para ayudar a los neurocientíficos a estudiar el cerebro en el que se unen tipos de células complejas y circuitos neuronales para generar cognición y comportamientos. NIH Blueprint for Neuroscience Research ha creado varios cientos de líneas de mouse con controlador Cre que actualmente utilizan la comunidad mundial de neurociencia.
Una aplicación importante del sistema Cre-lox es la escisión de marcadores seleccionables en el reemplazo de genes. Las estrategias de reemplazo de genes comúnmente utilizadas introducen marcadores seleccionables en el genoma para facilitar la selección de mutaciones genéticas que pueden causar retraso en el crecimiento. Sin embargo, la expresión de marcadores puede tener efectos polares en la expresión de genes ascendentes y descendentes. La eliminación de marcadores seleccionables del genoma mediante la recombinación Cre-lox es una forma elegante y eficaz de sortear este problema y, por tanto, se utiliza ampliamente en plantas, líneas celulares de ratón, levaduras, etc. [1]
El sistema consta de una única enzima, Cre recombinasa , que recombina un par de secuencias diana cortas llamadas secuencias Lox . Este sistema se puede implementar sin insertar proteínas o secuencias de soporte adicionales. La enzima Cre y el sitio Lox original llamado secuencia LoxP se derivan del bacteriófago P1 .
La colocación adecuada de secuencias de Lox permite activar, reprimir o intercambiar genes por otros genes. A nivel del ADN se pueden realizar muchos tipos de manipulaciones. La actividad de la enzima Cre se puede controlar para que se exprese en un tipo de célula particular o se desencadene mediante un estímulo externo como una señal química o un choque térmico. Estos cambios específicos en el ADN son útiles en el rastreo del linaje celular y cuando los mutantes son letales si se expresan globalmente.
El sistema Cre-Lox es muy similar en acción y uso al sistema de recombinación FLP-FRT . [2]
La recombinación Cre-Lox es un tipo especial de recombinación de sitio específico desarrollada por el Dr. Brian Sauer y patentada por DuPont que operaba tanto en células mitóticas como no mitóticas, y se usó inicialmente para activar la expresión genética en líneas celulares de mamíferos. [3] [4] [5] Posteriormente, investigadores en el laboratorio del Dr. Jamey Marth demostraron que la recombinación Cre-Lox podría usarse para eliminar secuencias de ADN cromosómico flanqueadas por loxP con alta eficiencia en células T en desarrollo específicas de animales transgénicos. Los autores proponen que este enfoque podría usarse para definir la función de genes endógenos en tipos de células específicos, marcar de forma indeleble progenitores en estudios de determinación del destino celular, inducir reordenamientos cromosómicos específicos para el modelado biológico y de enfermedades, y determinar el papel de las lesiones genéticas tempranas en las enfermedades. y fenotipo) mantenimiento. [6]
Poco después, investigadores del laboratorio del profesor Klaus Rajewsky informaron sobre la producción de células madre embrionarias pluripotentes que portaban un gen de ADN polimerasa flanqueado por loxP (floxed) dirigido. [7] Combinando estos avances en colaboración, los laboratorios de los Dres. Marth y Rajewsky informaron en 1994 que la recombinación Cre-lox podría usarse para la selección genética condicional. [8] Observaron que aproximadamente el 50 % del gen de la ADN polimerasa beta estaba eliminado en las células T basándose en la transferencia de ADN. No estaba claro si solo un alelo en cada célula T o el 50% de las células T tenían una eliminación del 100% en ambos alelos. Desde entonces, los investigadores han informado sobre una mutagénesis condicional del gen Cre-Lox más eficiente en las células T en desarrollo por el laboratorio Marth en 1995. [9] La eliminación incompleta por la recombinasa Cre no es infrecuente en células cuando existen dos copias de secuencias floxadas, y permite la formación y Estudio de tejidos quiméricos. Se ha demostrado que todos los tipos de células probados en ratones sufren recombinación Cre transgénica.
De forma independiente, Joe Z. Tsien ha sido pionero en el uso del sistema Cre-loxP para la manipulación de genes específicos de regiones y tipos de células en el cerebro adulto, donde pueden existir cientos de tipos distintos de neuronas y se sabe que casi todas las neuronas del cerebro adulto son post -mitótico. [10] Tsien y sus colegas demostraron que la recombinación mediada por Cre puede ocurrir en las neuronas piramidales postmitóticas en el cerebro anterior del ratón adulto. [11]
Estos avances han llevado a un uso generalizado de la mutagénesis condicional en la investigación biomédica, que abarca muchas disciplinas en las que se convierte en una plataforma poderosa para determinar la función genética en tipos de células específicas y en momentos de desarrollo específicos. En particular, la clara demostración de su utilidad para definir con precisión la compleja relación entre células/circuitos específicos y comportamientos para la investigación del cerebro, [12] ha promovido que los NIH inicien el Plan NIH para proyectos de ratón Cre-driver de investigación en neurociencia a principios de 2000. [13] [14] Hasta la fecha, los proyectos NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre han creado varios cientos de líneas de mouse con controlador Cre que actualmente utilizan la comunidad mundial de neurociencia.
La recombinación Cre-Lox implica apuntar a una secuencia específica de ADN y empalmarla con la ayuda de una enzima llamada Cre recombinasa . La recombinación Cre-Lox se utiliza comúnmente para evitar la letalidad embrionaria causada por la inactivación sistémica de muchos genes. [15] [16] A partir de febrero de 2019, la recombinación Cre-Lox es una herramienta poderosa y se utiliza en el modelado de animales transgénicos para vincular genotipos con fenotipos. [12] [17] [18]
El sistema Cre-lox se utiliza como herramienta genética para controlar eventos de recombinación específicos de sitio en el ADN genómico. Este sistema ha permitido a los investigadores manipular una variedad de organismos genéticamente modificados para controlar la expresión genética, eliminar secuencias de ADN no deseadas y modificar la arquitectura cromosómica.
La proteína Cre es una ADN recombinasa de sitio específico que puede catalizar la recombinación de ADN entre sitios específicos en una molécula de ADN. Estos sitios, conocidos como secuencias loxP , contienen sitios de unión específicos para Cre que rodean una secuencia central direccional donde puede ocurrir la recombinación.
Cuando las células que tienen sitios loxP en su genoma expresan Cre, puede ocurrir un evento de recombinación entre los sitios loxP . Las proteínas Cre recombinasa se unen a la primera y última regiones de 13 pb de un sitio lox formando un dímero . Este dímero luego se une a un dímero en otro sitio lox para formar un tetrámero . Los sitios Lox son direccionales y los dos sitios unidos por el tetrámero tienen una orientación paralela. La proteína Cre corta el ADN bicatenario en ambos sitios loxP . Luego, las hebras se vuelven a unir con la ADN ligasa en un proceso rápido y eficiente. El resultado de la recombinación depende de la orientación de los sitios loxP . Para dos sitios lox en el mismo brazo cromosómico, los sitios loxP invertidos provocarán una inversión del ADN intermedio, mientras que una repetición directa de los sitios loxP provocará un evento de eliminación. Si los sitios loxP están en cromosomas diferentes, es posible que los eventos de translocación sean catalizados por la recombinación inducida por Cre. Se pueden unir dos plásmidos utilizando los sitios lox variantes 71 y 66. [19]
La recombinasa Cre puede sintetizarse mediante el gen correspondiente bajo la dirección de promotores específicos de células, incluidos promotores bajo el control de la doxiciclina. Se puede lograr un nivel adicional de control utilizando su recombinasa Cre, diseñada para activarse de manera reversible en presencia del análogo de estrógeno 4-hidroxi tamoxifeno. Esto proporciona la ventaja de que la recombinasa Cre está activa durante un corto tiempo. Esto previene acciones no específicas de la recombinasa Cre. La recombinasa Cre puede reconocer sitios crípticos en el genoma del huésped e inducir una recombinación no autorizada, dañando el ADN del huésped. Esta herramienta es adecuada para eliminar genes de resistencia a los antibióticos, pero sobre todo permite inactivaciones condicionales que pueden inducirse en momentos específicos en el tipo de célula elegido. Es más probable que los modelos así obtenidos imiten la situación fisiológica. [20]
La proteína Cre (codificada por el locus originalmente denominado "Causa recombinación", y en algunas referencias se encuentra "Ciclación recombinasa") [21] [22] consta de 4 subunidades y dos dominios: el dominio carboxilo ( C-terminal ) más grande y un dominio amino ( N-terminal ) más pequeño. La proteína total tiene 343 aminoácidos . El dominio C es similar en estructura al dominio de la familia de enzimas Integrasa aisladas del fago lambda . Este es también el sitio catalítico de la enzima.
loxP (lugar de X-over P1) es un sitio en el bacteriófago P1 que consta de 34 pb . El sitio incluye una secuencia asimétrica de 8 pb, variable excepto por las dos bases intermedias, entre dos conjuntos de secuencias simétricas de 13 pb. La secuencia exacta se proporciona a continuación; 'N' indica bases que pueden variar y las letras minúsculas indican bases que han sido mutadas a partir del tipo salvaje. Las secuencias de 13 pb son palindrómicas pero el espaciador de 8 pb no lo es, dando así a la secuencia loxP una cierta dirección. Normalmente los sitios loxP vienen en pares para la manipulación genética. Si los dos sitios loxP están en la misma orientación, se corta la secuencia floxada (secuencia flanqueada por dos sitios loxP); sin embargo, si los dos sitios loxP están en orientación opuesta, la secuencia floxada se invierte. Si existe una secuencia donante floxed, la secuencia donante se puede intercambiar con la secuencia original. Esta técnica se llama intercambio de casetes mediado por recombinasa y es una forma muy conveniente y que ahorra tiempo para la manipulación genética. La advertencia, sin embargo, es que la reacción de recombinación puede ocurrir al revés, haciendo que el intercambio de casetes sea ineficiente. Además, la escisión de secuencia puede ocurrir en un evento de intercambio de casetes trans en lugar de in cis . Los mutantes loxP se crean para evitar estos problemas. [23]
Durante la recombinación genética, se forma una unión Holliday entre las dos hebras de ADN y una rotura de doble hebra en una molécula de ADN deja expuesto un extremo 3'OH. Esta reacción se ve favorecida por la actividad endonucleasa de una enzima. Los extremos 5' de fosfato suelen ser los sustratos para esta reacción, por lo que quedan regiones 3' extendidas. Este grupo 3' OH es muy inestable y la cadena en la que está presente debe encontrar su complemento. Dado que la recombinación homóloga ocurre después de la replicación del ADN, hay dos hebras de ADN disponibles y, por lo tanto, el grupo 3' OH debe emparejarse con su complemento, y lo hace, con una hebra intacta en el otro dúplex. Ahora, se ha producido un punto de cruce, que es lo que se llama Holliday Intermediate.
El extremo 3'OH se alarga (es decir, se añaden bases) con la ayuda de la ADN polimerasa. El emparejamiento de hebras opuestas es lo que constituye el evento de entrecruzamiento o recombinación, que es común a todos los organismos vivos, ya que el material genético de una hebra de un dúplex se ha emparejado con una hebra de otro dúplex y ha sido alargado por la ADN polimerasa. . Una mayor escisión de los intermedios de Holliday da como resultado la formación de ADN híbrido.
Esta mayor división o "resolvatación" se realiza mediante un grupo especial de enzimas llamadas resolvasas. RuvC es solo una de estas resolvasas que se han aislado en bacterias y levaduras.
Durante muchos años, se pensó que cuando se formara el intermedio de unión Holliday, el punto de bifurcación de la unión (donde se cruzan las hebras) se ubicaría en el primer sitio de escisión. La migración del punto de ramificación al segundo sitio de escisión desencadenaría de alguna manera la segunda mitad de la vía. Este modelo proporcionó una explicación conveniente para el estricto requisito de homología entre sitios de recombinación, ya que la migración de ramas se detendría ante un desajuste y no permitiría que se produjera el intercambio de la segunda cadena. Sin embargo, en años más recientes, esta visión ha sido cuestionada, y la mayoría de los modelos actuales para la recombinación de Int, Xer y Flp implican sólo una migración de ramas limitada (1 a 3 pares de bases del intermedio de Holliday), junto con un evento de isomerización que es responsable de cambiar la especificidad de escisión de la cadena.
La recombinación de sitio específico (SSR) involucra sitios específicos para la acción catalizadora de enzimas especiales llamadas recombinasas. Cre, o recombinasa cíclica, es una de esas enzimas. La recombinación específica de sitio es, por tanto, la escisión y ligación mediada por enzimas de dos secuencias de desoxinucleótidos definidas.
Se han descrito varios sistemas de recombinación conservados de sitios específicos tanto en organismos procarióticos como eucariotas. En general, estos sistemas utilizan una o más proteínas y actúan sobre secuencias de ADN asimétricas únicas. Los productos del evento de recombinación dependen de la orientación relativa de estas secuencias asimétricas. Muchas otras proteínas además de la recombinasa participan en la regulación de la reacción. Durante la recombinación de ADN de sitio específico, que provoca un reordenamiento genético en procesos como la integración y escisión viral y la segregación cromosómica, estas enzimas recombinasas reconocen secuencias de ADN específicas y catalizan el intercambio recíproco de cadenas de ADN entre estos sitios.
El inicio de la recombinación específica de sitio comienza con la unión de las proteínas de recombinación a sus respectivos objetivos de ADN. Una recombinasa separada reconoce y se une a cada uno de los dos sitios de recombinación en dos moléculas de ADN diferentes o dentro de la misma cadena de ADN. En el sitio específico dado en el ADN, el grupo hidroxilo de la tirosina en la recombinasa ataca a un grupo fosfato en la columna vertebral del ADN mediante un mecanismo de transesterificación directa . Esta reacción une la proteína recombinasa al ADN mediante un enlace fosfotirosina. Esto conserva la energía del enlace fosfodiéster, lo que permite revertir la reacción sin la participación de un cofactor de alta energía.
La escisión de la otra hebra también provoca un enlace fosfotirosina entre el ADN y la enzima. En ambos dúplex de ADN, la unión del grupo fosfato a los residuos de tirosina deja un grupo 3' OH libre en la columna vertebral del ADN. De hecho, el complejo enzima-ADN es una etapa intermedia, a la que le sigue la ligación del grupo 3' OH de una cadena de ADN al grupo 5' fosfato de la otra cadena de ADN, que está unido covalentemente al residuo de tirosina; es decir, se rompe el enlace covalente entre el extremo 5' y el residuo de tirosina. Esta reacción sintetiza la unión de Holliday analizada anteriormente.
De esta manera se unen hebras opuestas de ADN. La escisión y la reinserción posteriores hacen que las cadenas de ADN intercambien sus segmentos. Las interacciones proteína-proteína impulsan y dirigen el intercambio de cadenas. La energía no se ve comprometida, ya que el enlace proteína-ADN compensa la pérdida del enlace fosfodiéster que se produjo durante la escisión.
La recombinación de sitio específico también es un proceso importante que los virus, como los bacteriófagos, adoptan para integrar su material genético en el huésped infectado. El virus, llamado profago en tal estado, lo logra mediante integración y escisión. Los puntos donde ocurren las reacciones de integración y escisión se denominan sitios de unión (att). Un sitio attP en el fago intercambia segmentos con un sitio attB en el ADN bacteriano. Por lo tanto, estos son específicos del sitio y ocurren solo en los respectivos sitios att. La clase de enzimas integrasas cataliza esta reacción particular.
Se ha demostrado que dos factores afectan la eficiencia de la escisión de Cre en el par lox. Primero, la identidad de la secuencia de nucleótidos en la región espaciadora del sitio lox. Las variantes de lox diseñadas que difieren en la región espaciadora tienden a tener una eficiencia de recombinación variada pero generalmente menor en comparación con el loxP de tipo salvaje, presumiblemente al afectar la formación y resolución del intermedio de recombinación. [26]
Otro factor es la longitud del ADN entre el par lox. El aumento de la longitud del ADN conduce a una menor eficiencia de la recombinación Cre/lox, posiblemente mediante la regulación de la dinámica de la reacción. [27] [28] [29] La ubicación genética de la secuencia floxed también afecta la eficiencia de la recombinación, probablemente al influir en la disponibilidad de ADN por la recombinasa Cre . [29] La elección del controlador Cre también es importante ya que la baja expresión de la recombinasa Cre tiende a dar como resultado una recombinación no paralela. La recombinación no paralela es especialmente problemática en un escenario de mapeo de destino donde un evento de recombinación está diseñado para manipular el gen en estudio y el otro evento de recombinación es necesario para activar un gen informador (generalmente que codifica una proteína fluorescente) para el rastreo del linaje celular . [29] La imposibilidad de activar ambos eventos de recombinación simultáneamente confunde la interpretación de los resultados del mapeo del destino celular .
La activación inducible de Cre se logra utilizando la variante CreER (receptor de estrógeno), que solo se activa después de la administración de tamoxifeno . [30] Esto se hace mediante la fusión de un dominio de unión a ligando mutado del receptor de estrógeno a la recombinasa Cre, lo que da como resultado que Cre se active específicamente por el tamoxifeno. En ausencia de tamoxifeno, CreER provocará el transporte de la recombinasa mutada al citoplasma. La proteína permanecerá en este lugar en su estado inactivado hasta que se administre tamoxifeno. Una vez que se introduce el tamoxifeno, se metaboliza en 4-hidroxitamoxifeno, que luego se une al RE y produce la translocación del CreER al núcleo, donde luego puede escindir los sitios lox. [31] Es importante destacar que a veces los reporteros fluorescentes pueden activarse en ausencia de tamoxifeno, debido a la fuga de algunas moléculas de recombinasa Cre hacia el núcleo que, en combinación con reporteros muy sensibles, da como resultado un marcaje celular no deseado. [32] CreER(T2) se desarrolló para minimizar la recombinación independiente del tamoxifeno y maximizar la sensibilidad al tamoxifeno.
Las células alteran su fenotipo en respuesta a numerosos estímulos ambientales y pueden perder la expresión de genes que normalmente se utilizan para marcar su identidad, lo que dificulta la investigación de la contribución de ciertos tipos de células a las enfermedades. Por lo tanto, los investigadores suelen utilizar ratones transgénicos que expresan la recombinasa CreER t2 inducida por la administración de tamoxifeno, bajo el control de un promotor de un gen que marca el tipo de célula específica de interés, con una proteína indicadora fluorescente dependiente de Cre. La recombinasa Cre está fusionada a una forma mutante del receptor de estrógeno, que se une al estrógeno sintético 4-hidroxitamoxifeno en lugar de su ligando natural 17β-estradiol. CreER(T2) reside dentro del citoplasma y solo puede trasladarse al núcleo después de la administración de tamoxifeno, lo que permite un estricto control temporal de la recombinación. El casete indicador fluorescente contendrá un promotor para permitir una alta expresión del indicador transgén fluorescente (por ejemplo, un promotor CAG) y un casete de parada flanqueado por loxP, asegurando que la expresión del transgén dependa de la recombinasa Cre y de la secuencia indicadora. Tras la recombinación impulsada por Cre, el casete de parada se escinde, lo que permite que los genes indicadores se expresen específicamente en células en las que la expresión de Cre está siendo impulsada por el promotor marcador específico de la célula. Dado que la eliminación del casete de parada es permanente, los genes indicadores se expresan en toda la progenie producida por las células iniciales donde una vez se activó Cre. Dicho rastreo de linaje condicional ha demostrado ser extremadamente útil para identificar de manera eficiente y específica células del músculo liso vascular (VSMC) y células derivadas de VSMC y se ha utilizado para probar los efectos en VSMC y células derivadas de VSMC in vivo. [33] [34] [35 ] [36] [37] [38]
El fago P1 es un fago templado que provoca un ciclo lisogénico o lítico cuando infecta una bacteria. En su estado lítico, una vez que su genoma viral se inyecta en la célula huésped, se producen proteínas virales, se ensamblan los viriones y la célula huésped se lisa para liberar los fagos, continuando el ciclo. En el ciclo lisogénico, el genoma del fago se replica con el resto del genoma bacteriano y se transmite a las células hijas en cada división celular posterior. Puede pasar al ciclo lítico por un evento posterior como la radiación ultravioleta o la inanición.
Los fagos como el fago lambda utilizan sus recombinasas específicas de sitio para integrar su ADN en el genoma del huésped durante la lisogenia. El ADN del fago P1, por otro lado, existe como plásmido en el huésped. El sistema Cre-lox cumple varias funciones en el fago: circulariza el ADN del fago en un plásmido, separa los anillos de plásmido interconectados para que pasen a ambas bacterias hijas por igual y puede ayudar a mantener el número de copias a través de un medio alternativo de replicación. [39]
El ADN del fago P1, cuando el virión lo libera en el huésped, tiene la forma de una molécula de ADN lineal de doble hebra. La enzima Cre se dirige a los sitios loxP en los extremos de esta molécula y cicla el genoma. Esto también puede ocurrir en ausencia del sistema Crelox [40] con la ayuda de otras proteínas bacterianas y virales. El plásmido P1 es relativamente grande (≈90 Kbp) y, por lo tanto, existe en un número de copias bajo, generalmente una por célula. Si los dos plásmidos hijos se interconectan, una de las células hijas del huésped perderá el plásmido. El sistema de recombinación Cre-lox previene estas situaciones desvinculando los anillos del ADN mediante la realización de dos eventos de recombinación (anillos unidos -> anillo único fusionado -> dos anillos no unidos). También se propone que la replicación en círculo rodante seguida de recombinación permitirá que el plásmido aumente su número de copias cuando ciertos reguladores (repA) sean limitantes. [39]
Una estrategia clásica para generar variantes de deleción de genes se basa en la doble integración cruzada de vectores no replicantes en el genoma. Además, los sistemas de recombinación como Cre-lox se utilizan ampliamente, principalmente en eucariotas. Las propiedades versátiles de la recombinasa Cre la hacen ideal para su uso en muchas estrategias de ingeniería genética. Como tal, el sistema Cre lox se ha utilizado en una amplia variedad de eucariotas, incluidas plantas. [41]
Los investigadores han utilizado múltiples variantes de loxP, [42] en particular lox2272 y loxN, con la combinación de diferentes acciones Cre (transitorias o constitutivas) para crear un sistema " Brainbow " que permite colorear el cerebro de los ratones con cuatro proteínas fluorescentes. .
Otro informe que utiliza dos pares de variantes de lox pero mediante la regulación de la longitud del ADN en un par da como resultado una activación genética estocástica con un nivel regulado de escasez. [27]