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Microscopía de excitación de dos fotones.

"Microscopía de excitación de dos fotones del intestino de un ratón ". Rojo: actina . Verde: núcleos celulares . Azul: moco de células caliciformes . Obtenido a 780 nm utilizando un láser de Ti-zafiro .

La microscopía de excitación de dos fotones ( TPEF o 2PEF ) es una técnica de imágenes de fluorescencia que es particularmente adecuada para obtener imágenes de tejido vivo disperso de hasta aproximadamente un milímetro de espesor. A diferencia de la microscopía de fluorescencia tradicional , donde la longitud de onda de excitación es más corta que la longitud de onda de emisión, la excitación de dos fotones requiere la excitación simultánea de dos fotones con una longitud de onda más larga que la luz emitida. El láser se enfoca en una ubicación específica del tejido y se escanea a través de la muestra para producir la imagen de forma secuencial. Debido a la no linealidad de la excitación de dos fotones, se excitan principalmente los fluoróforos en el foco micrométrico del rayo láser, lo que da como resultado la resolución espacial de la imagen. Esto contrasta con la microscopía confocal , donde la resolución espacial se produce mediante la interacción del foco de excitación y la detección confinada con un orificio.

La microscopía de excitación de dos fotones normalmente utiliza luz de excitación del infrarrojo cercano (NIR) que también puede excitar tintes fluorescentes . El uso de luz infrarroja minimiza la dispersión en el tejido porque la luz infrarroja se dispersa menos en los tejidos biológicos típicos. Debido a la absorción multifotónica, la señal de fondo se suprime fuertemente. Ambos efectos conducen a una mayor profundidad de penetración para esta técnica. La excitación de dos fotones puede ser una alternativa superior a la microscopía confocal debido a su penetración más profunda en el tejido, detección de luz eficiente y fotoblanqueo reducido . [1] [2]

Imagen de fluorescencia de dos fotones (verde) de una sección transversal de rizoma coloreado con lirio de los valles . La excitación está a 840 nm y los colores rojo y azul representan otros canales de técnicas multifotónicas que se han superpuesto.

Concepto

Representación esquemática de los niveles de energía (diagramas de Jabłoński) del proceso de fluorescencia, ejemplo de un tinte fluorescente que emite luz a 460 nm. Se absorben uno (púrpura, 1PEF), dos (rojo claro, 2PEF) o tres (rojo oscuro, 3PEF) para emitir un fotón de fluorescencia (turquesa).
Respuesta óptica de una fuente puntual. De izquierda a derecha: distribuciones de intensidad calculadas xy (arriba) y rz (abajo), con escala logarítmica, para una fuente puntual obtenida mediante un campo amplio (a), 2PEF (b) y microscopía confocal (c). Las formas 2PEF y confocales tienen una mejor relación señal-ruido que el campo amplio. La distribución 2PEF es mayor debido a que la responsable de la distribución de intensidad es una longitud de onda dos veces más larga que en el caso de un campo amplio o confocal. Estas distribuciones de intensidad también se conocen como funciones de dispersión puntual. Condiciones ópticas: las longitudes de onda de excitación son 488 nm y 900 nm respectivamente para 1PEF y 2PEF; la longitud de onda de emisión es de 520 nm; la apertura numérica es 1,3 con un objetivo de inmersión en aceite .

La excitación de dos fotones emplea la absorción de dos fotones , un concepto descrito por primera vez por Maria Goeppert Mayer (1906-1972) en su tesis doctoral en 1931, [3] y observado por primera vez en 1961 en un cristal de CaF 2 :Eu 2+ utilizando excitación láser . por Wolfgang Káiser . [4] Isaac Abella demostró en 1962 con vapor de cesio que es posible la excitación de dos fotones de átomos individuales. [5]

La microscopía de fluorescencia de excitación de dos fotones tiene similitudes con otras técnicas de microscopía láser confocal, como la microscopía confocal de barrido láser y la microscopía Raman . Estas técnicas utilizan rayos láser enfocados escaneados en un patrón rasterizado para generar imágenes, y ambas tienen un efecto de sección óptica . A diferencia de los microscopios confocales, los microscopios multifotónicos no contienen aberturas estenopeicas que les dan a los microscopios confocales su calidad de corte óptico. El corte óptico producido por los microscopios multifotónicos es el resultado de la función de dispersión puntual de la excitación. El concepto de excitación de dos fotones se basa en la idea de que dos fotones, de energía fotónica comparativamente menor que la necesaria para la excitación de un fotón, también pueden excitar un fluoróforo en un evento cuántico. Cada fotón transporta aproximadamente la mitad de la energía necesaria para excitar la molécula. El fotón emitido tiene una energía más alta (longitud de onda más corta) que cualquiera de los dos fotones excitantes. La probabilidad de que dos fotones se absorban casi simultáneamente es extremadamente baja. Por lo tanto, normalmente se requiere un flujo máximo alto de fotones de excitación, generalmente generado por un láser pulsado de femtosegundo . Por ejemplo, la misma potencia promedio del láser pero sin pulsaciones da como resultado una fluorescencia no detectable en comparación con la fluorescencia generada por el láser pulsado mediante el efecto de dos fotones. Los láseres de excitación de longitud de onda más larga y menor energía (típicamente infrarrojos) de los microscopios multifotónicos son muy adecuados para su uso en la obtención de imágenes de células vivas, ya que causan menos daño que los láseres de longitud de onda corta que normalmente se usan para la excitación de un solo fotón, por lo que se pueden observar tejidos vivos. durante períodos más largos con menos efectos tóxicos.

Los fluoróforos más utilizados tienen espectros de excitación en el rango de 400 a 500 nm, mientras que el láser utilizado para excitar la fluorescencia de dos fotones se encuentra en el rango de ~ 700 a 1100 nm (infrarrojos) producido por láseres de Ti-zafiro . Si el fluoróforo absorbe dos fotones infrarrojos simultáneamente, absorberá suficiente energía para pasar al estado excitado. Luego, el fluoróforo emitirá un único fotón con una longitud de onda que depende del tipo de fluoróforo utilizado (normalmente en el espectro visible). Debido a que se absorben dos fotones durante la excitación del fluoróforo, la probabilidad de emisión fluorescente de los fluoróforos aumenta cuadráticamente con la intensidad de excitación. Por lo tanto, se genera mucha más fluorescencia de dos fotones cuando el rayo láser está muy enfocado que donde es más difuso. Efectivamente, la excitación se restringe al pequeño volumen focal (~1 femtolitro), lo que resulta en un alto grado de rechazo de objetos desenfocados. Esta localización de la excitación es la ventaja clave en comparación con los microscopios de excitación de fotón único , que necesitan emplear elementos como poros para rechazar la fluorescencia desenfocada. Luego, un detector de alta sensibilidad, como un tubo fotomultiplicador , recoge la fluorescencia de la muestra . Esta intensidad de luz observada se convierte en un píxel en la imagen final; el punto focal se escanea a lo largo de una región deseada de la muestra para formar todos los píxeles de la imagen.

Desarrollo

Un diagrama de un microscopio de dos fotones.

La microscopía de dos fotones fue iniciada y patentada por Winfried Denk y James Strickler en el laboratorio de Watt W. Webb en la Universidad de Cornell en 1990. Combinaron la idea de la absorción de dos fotones con el uso de un escáner láser. [1] [6] En la microscopía de excitación de dos fotones, un rayo láser infrarrojo se enfoca a través de una lente objetivo. El láser de zafiro de Ti que se utiliza normalmente tiene un ancho de pulso de aproximadamente 100 femtosegundos (fs) y una velocidad de repetición de aproximadamente 80 MHz, lo que permite la alta densidad de fotones y el flujo necesarios para la absorción de dos fotones, y se puede sintonizar en una amplia gama de longitudes de onda. .

El uso de luz infrarroja para excitar fluoróforos en tejidos que dispersan la luz tiene beneficios adicionales. [7] Las longitudes de onda más largas se dispersan en menor grado que las más cortas, lo que supone una ventaja para las imágenes de alta resolución. Además, es menos probable que estos fotones de menor energía causen daños fuera del volumen focal. En comparación con un microscopio confocal, la detección de fotones es mucho más eficaz, ya que incluso los fotones dispersos contribuyen a la señal utilizable. Estos beneficios de la obtención de imágenes en tejidos dispersos sólo se reconocieron varios años después de la invención de la microscopía de excitación de dos fotones. [8]

Hay varias advertencias sobre el uso de microscopía de dos fotones: los láseres pulsados ​​necesarios para la excitación de dos fotones son mucho más caros que los láseres de onda continua (CW) utilizados en microscopía confocal. El espectro de absorción de dos fotones de una molécula puede variar significativamente respecto de su homólogo de un fotón. El fotodaño de orden superior se convierte en un problema y el blanqueamiento aumenta con el cuadrado de la potencia del láser, mientras que es lineal para un fotón único (confocal). Para objetos muy delgados, como células aisladas, los microscopios de fotón único (confocales) pueden producir imágenes con mayor resolución óptica debido a sus longitudes de onda de excitación más cortas. Por otro lado, en la dispersión de tejido, las capacidades superiores de seccionamiento óptico y detección de luz del microscopio de dos fotones dan como resultado un mejor rendimiento.

Aplicaciones

Principal

La microscopía de dos fotones ha estado involucrada en numerosos campos, incluidos: fisiología, neurobiología, embriología e ingeniería de tejidos. Incluso los tejidos finos y casi transparentes (como las células de la piel) se han visualizado con gran detalle gracias a esta técnica. [9] Las capacidades de obtención de imágenes de alta velocidad de la microscopía de dos fotones también se pueden utilizar en la biopsia óptica no invasiva. [10] La microscopía de dos fotones se ha utilizado acertadamente para producir reacciones químicas localizadas, [8] y efecto que también se ha utilizado para la litografía basada en dos fotones . Utilizando microscopía basada en fluorescencia de dos fotones y generación de segundos armónicos , se demostró que las moléculas orgánicas de tipo porfirina pueden tener diferentes momentos dipolares de transición para la fluorescencia de dos fotones y la generación de segundos armónicos, [11] que de otro modo se cree que ocurren a partir de la fluorescencia de dos fotones y la generación de segundos armónicos. mismo momento dipolar de transición. [12] Se demostró que la excitación no degenerativa de dos fotones, o el uso de 2 fotones de longitudes de onda desiguales, aumenta la fluorescencia de todas las moléculas pequeñas y proteínas fluorescentes analizadas. [13]

Investigación sobre el cáncer

También se demostró que 2PEF es muy valioso para caracterizar el cáncer de piel. [14] También se ha demostrado que revela la detención de las células tumorales, la interacción entre las células tumorales y las plaquetas, la interacción entre las células tumorales y los leucocitos y los procesos de colonización metastásica. [15]

Investigación embrionaria

2PEF ha demostrado ser ventajoso sobre otras técnicas, como la microscopía confocal , cuando se trata de imágenes de células vivas a largo plazo de embriones de mamíferos. [dieciséis]

investigación renal

2PEF también se ha utilizado en la visualización de tipos de células de difícil acceso, especialmente en lo que respecta a las células renales. [17] Se ha utilizado para comprender mejor la dinámica de fluidos y la filtración. [18]

Diagrama de imágenes de la función cerebral in vivo. Muestra el esquema general de imágenes, junto con imágenes neuronales y vasculares. Las imágenes se realizaron utilizando varios tintes fluorescentes.

Neurociencias

2PEF, así como la extensión de este método a 3PEF , se utilizan para caracterizar tejidos neurales intactos en el cerebro de animales vivos e incluso comportándose. En particular, el método es ventajoso para la obtención de imágenes de calcio de una neurona o poblaciones de neuronas, [19] para la fotofarmacología , incluida la liberación localizada de componentes como el glutamato [20] o la isomerización de fármacos fotoconmutables, [21] [22] y para la obtención de imágenes de otros sensores codificados genéticamente que informan la concentración de neurotransmisores. [23]

Actualmente, la microscopía de dos fotones se utiliza ampliamente para obtener imágenes de la activación real de neuronas en organismos modelo, incluidas moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ) , ratas , pájaros cantores , primates , hurones , ratones ( Mus musculus ) y peces cebra . [24] [25] [26] Los animales suelen tener la cabeza fija debido al tamaño del microscopio y los dispositivos de escaneo, pero también se están desarrollando microscopios en miniatura que permiten obtener imágenes de las neuronas de los animales que se mueven y se comportan libremente. [27] [28]

Excitación de orden superior

También es posible la absorción simultánea de tres o más fotones, lo que permite la microscopía de excitación multifotónica de orden superior. [29] La llamada "microscopía de fluorescencia de excitación de tres fotones" (3PEF) es la técnica más utilizada después de la 2PEF, a la que es complementaria. También se ha informado de la isomerización localizada de fármacos fotoconmutables in vivo mediante excitación de tres fotones. [30]

Tintes y proteínas fluorescentes para microscopía de excitación de dos fotones.

En general, todas las proteínas fluorescentes de uso común (CFP, GFP, YFP, RFP) y colorantes se pueden excitar en modo de dos fotones. Los espectros de excitación de dos fotones suelen ser considerablemente más amplios, lo que dificulta la excitación selectiva de los fluoróforos cambiando las longitudes de onda de excitación. [ cita necesaria ]

Se han informado varios tintes emisores de color verde, rojo y NIR (sondas y etiquetas reactivas) con secciones transversales de absorción de 2 fotones extremadamente altas. [31] Debido a la estructura de tipo donante-aceptor-donante, los tintes de escuaraína como Seta-670 , Seta-700 y Seta-660 exhiben eficiencias de absorción de 2 fotones (2PA) muy altas en comparación con otros tintes, [31] [ 32] [33] SeTau-647 y SeTau-665 , un nuevo tipo de escuarena- rotaxano , exhiben secciones transversales de acción de dos fotones extremadamente altas, de hasta 10 000 GM en la región IR cercana, insuperables por cualquier otra clase de tintes orgánicos. . [31]

Ver también

Fuentes

Referencias

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