La microscopía de imágenes de segundo armónico ( SHIM ) se basa en un efecto óptico no lineal conocido como generación de segundo armónico (SHG). La SHIM se ha establecido como un mecanismo viable de contraste de imágenes microscópicas para la visualización de la estructura y función de células y tejidos . [1] Un microscopio de segundo armónico obtiene contrastes a partir de variaciones en la capacidad de una muestra para generar luz de segundo armónico a partir de la luz incidente, mientras que un microscopio óptico convencional obtiene su contraste detectando variaciones en la densidad óptica , la longitud del camino o el índice de refracción de la muestra. La SHG requiere una luz láser intensa que pase a través de un material con una estructura molecular no centrosimétrica , ya sea inherente o inducida externamente, por ejemplo, por un campo eléctrico. [2]
La luz de segundo armónico que emerge de un material SHG es exactamente la mitad de la longitud de onda (frecuencia duplicada) de la luz que ingresa al material. Si bien la fluorescencia excitada por dos fotones (TPEF, por sus siglas en inglés) también es un proceso de dos fotones, la TPEF pierde algo de energía durante la relajación del estado excitado, mientras que la SHG conserva la energía. Por lo general, se utiliza un cristal inorgánico para producir luz SHG, como el niobato de litio (LiNbO 3 ), el fosfato de titanilo y potasio (KTP = KTiOPO 4 ) y el triborato de litio (LBO = LiB 3 O 5 ). Aunque la SHG requiere que un material tenga una orientación molecular específica para que la luz incidente se duplique en frecuencia, algunos materiales biológicos pueden ser altamente polarizables y ensamblarse en estructuras no centrosimétricas grandes y bastante ordenadas. Si bien algunos materiales biológicos como el colágeno, los microtúbulos y la miosina muscular [3] pueden producir señales SHG, incluso el agua puede ordenarse y producir una señal de segundo armónico en determinadas condiciones, lo que permite que la microscopía SH obtenga imágenes de potenciales de superficie sin ninguna molécula de etiquetado. [2] El patrón SHG está determinado principalmente por la condición de coincidencia de fase. Una configuración común para un sistema de imágenes SHG tendrá un microscopio de escaneo láser con un láser de modo bloqueado de zafiro de titanio como fuente de excitación. La señal SHG se propaga en dirección hacia adelante. Sin embargo, algunos experimentos han demostrado que los objetos del orden de aproximadamente una décima parte de la longitud de onda de la señal producida por SHG producirán señales hacia adelante y hacia atrás casi iguales.
Ventajas
La SHIM ofrece varias ventajas para la obtención de imágenes de células y tejidos vivos. La SHG no implica la excitación de moléculas como otras técnicas como la microscopía de fluorescencia , por lo tanto, las moléculas no deberían sufrir los efectos de la fototoxicidad o el fotoblanqueo . Además, dado que muchas estructuras biológicas producen fuertes señales de SHG, no se requiere el etiquetado de moléculas con sondas exógenas , lo que también puede alterar la forma en que funciona un sistema biológico. Al utilizar longitudes de onda de infrarrojo cercano para la luz incidente, la SHIM tiene la capacidad de construir imágenes tridimensionales de muestras al obtener imágenes más profundas de tejidos gruesos.
Diferencia y complementariedad con la fluorescencia de dos fotones (2PEF)
La fluorescencia de dos fotones ( 2PEF ) es un proceso muy diferente de la SHG : implica la excitación de electrones a niveles de energía más altos y la posterior desexcitación por emisión de fotones (a diferencia de la SHG, aunque también es un proceso de 2 fotones). Por lo tanto, la 2PEF es un proceso no coherente , espacialmente (emitido isotrópicamente) y temporalmente (espectro amplio, dependiente de la muestra). Tampoco es específico de cierta estructura, a diferencia de la SHG. [4]
Por lo tanto, se puede acoplar a SHG en imágenes multifotónicas para revelar algunas moléculas que sí producen autofluorescencia , como la elastina en los tejidos (mientras que SHG revela colágeno o miosina , por ejemplo). [4]
Historia
Antes de que se utilizara SHG para la obtención de imágenes, la primera demostración de SHG fue realizada en 1961 por PA Franken, G. Weinreich, CW Peters y AE Hill en la Universidad de Michigan, Ann Arbor, utilizando una muestra de cuarzo. [5] En 1968, Bloembergen descubrió SHG de las interfaces [6] y desde entonces se ha utilizado como herramienta para caracterizar superficies y sondear la dinámica de las interfaces. En 1971, Fine y Hansen informaron de la primera observación de SHG a partir de muestras de tejido biológico. [7] En 1974, Hellwarth y Christensen informaron por primera vez de la integración de SHG y microscopía mediante la obtención de imágenes de señales de SHG a partir de ZnSe policristalino . [8] En 1977, Colin Sheppard obtuvo imágenes de varios cristales de SHG con un microscopio óptico de barrido. Los primeros experimentos de obtención de imágenes biológicas fueron realizados por Freund y Deutsch en 1986 para estudiar la orientación de las fibras de colágeno en el tendón de la cola de rata . [9] En 1993, Lewis examinó la respuesta del segundo armónico de los colorantes de estirilo en campos eléctricos . También mostró su trabajo sobre la obtención de imágenes de células vivas. En 2006, el grupo de Goro Mizutani desarrolló un microscopio SHG sin barrido que acorta significativamente el tiempo necesario para la observación de muestras grandes, incluso si el microscopio de campo amplio de dos fotones se publicó en 1996 [10] y podría haberse utilizado para detectar SHG. El microscopio SHG sin barrido se utilizó para la observación de almidón vegetal , [11] [12] megamoléculas, [13] seda de araña [14] [15] , etc. En 2010, el SHG se extendió a la obtención de imágenes in vivo de animales completos . [16] [17] En 2019, las aplicaciones del SHG se ampliaron cuando se aplicó al uso de imágenes selectivas de agroquímicos directamente sobre las superficies de las hojas para proporcionar una forma de evaluar la eficacia de los pesticidas. [18]
Mediciones cuantitativas
Anisotropía orientacional
La anisotropía de polarización de SHG se puede utilizar para determinar la orientación y el grado de organización de las proteínas en los tejidos, ya que las señales de SHG tienen polarizaciones bien definidas. Mediante el uso de la ecuación de anisotropía: [19]
y adquiriendo las intensidades de las polarizaciones en las direcciones paralelas y perpendiculares. Un valor alto indica una orientación anisotrópica mientras que un valor bajo indica una estructura isotrópica. En el trabajo realizado por Campagnola y Loew, [19] se encontró que las fibras de colágeno formaban estructuras bien alineadas con un valor.
SHG hacia adelante sobre hacia atrás
La SHG es un proceso coherente ( espacial y temporalmente ), por lo que conserva información sobre la dirección de la excitación y no se emite de forma isótropa. Se emite principalmente en dirección hacia delante (igual que la excitación), pero también puede emitirse en dirección hacia atrás según la condición de coincidencia de fase . De hecho, la longitud de coherencia más allá de la cual disminuye la conversión de la señal es:
con para adelante, pero para atrás tal que >> . Por lo tanto, las estructuras más gruesas aparecerán preferentemente en adelante, y las más delgadas en atrás: dado que la conversión SHG depende en primera aproximación del cuadrado del número de convertidores no lineales, la señal será mayor si es emitida por estructuras gruesas, por lo que la señal en dirección hacia adelante será mayor que en atrás. Sin embargo, el tejido puede dispersar la luz generada, y una parte del SHG en dirección hacia adelante puede retrorreflejarse en dirección hacia atrás. [20]
Luego, se puede calcular la relación hacia adelante sobre hacia atrás F/B, [20] y es una métrica del tamaño global y la disposición de los convertidores SHG (generalmente fibrillas de colágeno). También se puede demostrar que cuanto mayor sea el ángulo fuera del plano del dispersor, mayor será su relación F/B (ver fig. 2.14 de [21] ).
SHG con resolución de polarización
Las ventajas de la polarimetría fueron acopladas a la SHG en 2002 por Stoller et al. [22] La polarimetría puede medir la orientación y el orden a nivel molecular, y acoplada a la SHG puede hacerlo con la especificidad de ciertas estructuras como el colágeno: la microscopía SHG resuelta por polarización (p-SHG) es, por lo tanto, una expansión de la microscopía SHG. [23]
La p-SHG define otro parámetro de anisotropía, como: [24]
que es, como r , una medida de la orientación principal y el desorden de la estructura que se está fotografiando. Dado que a menudo se realiza en filamentos cilíndricos largos (como el colágeno), esta anisotropía es a menudo igual a
, [25] donde es el tensor de susceptibilidad no lineal y X la dirección del filamento (o dirección principal de la estructura), Y ortogonal a X y Z la propagación de la luz de excitación. La orientación ϕ de los filamentos en el plano XY de la imagen también se puede extraer de p-SHG mediante análisis FFT y colocar en un mapa. [25] [26]
Cuantificación de la fibrosis
El colágeno (caso particular, pero ampliamente estudiado en microscopía SHG), puede existir en diversas formas: 28 tipos diferentes, de los cuales 5 son fibrilares. Uno de los retos es determinar y cuantificar la cantidad de colágeno fibrilar en un tejido, para poder ver su evolución y relación con otros materiales no colagenosos. [27]
Para ello, es necesario corregir la imagen obtenida mediante microscopía SHG para eliminar la pequeña cantidad de fluorescencia residual o ruido que existe en la longitud de onda SHG. Después, se puede aplicar una máscara para cuantificar el colágeno dentro de la imagen. [27] Entre otras técnicas de cuantificación, es probablemente la que presenta mayor especificidad, reproducibilidad y aplicabilidad a pesar de ser bastante compleja. [27]
Otros
También se ha utilizado para demostrar que los potenciales de acción retropropagados invaden las espinas dendríticas sin atenuación de voltaje, lo que establece una base sólida para futuros trabajos sobre la potenciación a largo plazo . Su uso aquí fue que proporcionó una forma de medir con precisión el voltaje en las diminutas espinas dendríticas con una precisión inalcanzable con la microscopía estándar de dos fotones. [28] Mientras tanto, SHG puede convertir de manera eficiente la luz infrarroja cercana en luz visible para permitir la terapia fotodinámica guiada por imágenes, superando las limitaciones de profundidad de penetración. [29]
Materiales que se pueden imaginar
La microscopía SHG y sus expansiones se pueden utilizar para estudiar diversos tejidos: en la figura siguiente se muestran algunas imágenes de ejemplo: el colágeno dentro de la matriz extracelular sigue siendo la principal aplicación. Se puede encontrar en tendones, piel, huesos, córnea, aorta, fascia, cartílago, menisco, discos intervertebrales...
La miosina también se puede visualizar en el músculo esquelético o en el músculo cardíaco.
Acoplamiento con microscopía THG
La microscopía de generación de tercer armónico (THG) puede ser complementaria a la microscopía SHG, ya que es sensible a las interfaces transversales y a la susceptibilidad no lineal de tercer orden [35] [36]
La comparación de imágenes SHG hacia adelante y hacia atrás brinda información sobre la microestructura del colágeno, relacionada en sí misma con el grado y el estadio de un tumor , y su progresión en la mama . [39] La comparación de SHG y 2PEF también puede mostrar el cambio de orientación del colágeno en los tumores . [40]
Incluso si la microscopía SHG ha contribuido mucho a la investigación del cáncer de mama, aún no se ha establecido como una técnica confiable en los hospitales , o para el diagnóstico de esta patología en general. [39]
Cáncer de ovario
Los ovarios sanos presentan en SHG una capa epitelial uniforme y colágeno bien organizado en su estroma , mientras que los anormales muestran un epitelio con células grandes y una estructura de colágeno alterada. [39] La relación r (ver #Anisotropía orientacional) también se utiliza [41] para mostrar que la alineación de las fibrillas es ligeramente mayor en los tejidos cancerosos que en los normales.
Cáncer de piel
SHG se combina, nuevamente, con 2PEF y se utiliza para calcular la relación:
donde shg (resp. tpef) es el número de píxeles con umbral en la imagen SHG (resp. 2PEF), [42] un MFSI alto significa una imagen SHG pura (sin fluorescencia). El MFSI más alto se encuentra en tejidos cancerosos, [39] lo que proporciona un modo de contraste para diferenciarlos de los tejidos normales.
La SHG también se combinó con la generación de tercer armónico (THG) para demostrar que la THG hacia atrás (ver #SHG hacia adelante sobre SHG hacia atrás) es mayor en los tumores. [43]
Cáncer de páncreas
Los cambios en la ultraestructura del colágeno en el cáncer de páncreas se pueden investigar mediante fluorescencia multifotónica y SHIM con resolución de polarización. [44]
Las alteraciones en la organización o polaridad de las fibrillas de colágeno pueden ser signos de patología. [45] [46]
En particular, la alineación anisotrópica de las fibras de colágeno permitió la discriminación de la dermis sana de las cicatrices patológicas en la piel . [47] Además, las patologías en el cartílago como la osteoartritis se pueden investigar mediante microscopía SHG resuelta por polarización. [48] [49] SHIM se extendió posteriormente al fibrocartílago ( menisco ). [50]
Ingeniería de tejidos
La capacidad de SHG para obtener imágenes de moléculas específicas puede revelar la estructura de un determinado tejido, un material a la vez, y en varias escalas (de macro a micro) utilizando microscopía. Por ejemplo, el colágeno (tipo I) se obtiene específicamente de la matriz extracelular (ECM) de las células, o cuando sirve como andamio o material conjuntivo en los tejidos. [51] SHG también revela fibroína en la seda , miosina en los músculos y celulosa biosintetizada . Toda esta capacidad de obtención de imágenes se puede utilizar para diseñar tejidos artificiales, al apuntar a puntos específicos del tejido: SHG puede, de hecho, medir cuantitativamente algunas orientaciones y la cantidad y disposición del material. [51] Además, SHG acoplado a otras técnicas multifotónicas puede servir para monitorear el desarrollo de tejidos diseñados, cuando la muestra es relativamente delgada. [52] Por supuesto, finalmente se pueden utilizar como un control de calidad de los tejidos fabricados. [52]
Estructura del ojo
Se considera que la córnea , en la superficie del ojo , está hecha de una estructura de colágeno similar a la madera contrachapada , debido a las propiedades de autoorganización del colágeno suficientemente denso . [53] Sin embargo, la orientación del colágeno en las láminas aún está en debate en este tejido . [54] La córnea del queratocono también se puede visualizar mediante SHG para revelar alteraciones morfológicas del colágeno . [55] Además, la microscopía de generación de terceros armónicos (THG) se utiliza para obtener imágenes de la córnea , que es complementaria a la señal SHG, ya que los máximos de THG y SHG en este tejido a menudo se encuentran en lugares diferentes. [56]
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