El seccionamiento óptico es el proceso mediante el cual un microscopio adecuadamente diseñado puede producir imágenes claras de planos focales en lo profundo de una muestra gruesa. Esto se utiliza para reducir la necesidad de realizar cortes finos utilizando instrumentos como el microtomo . Se utilizan muchas técnicas diferentes para el corte óptico y varias técnicas de microscopía están diseñadas específicamente para mejorar la calidad del corte óptico.
Un buen seccionamiento óptico, a menudo denominado buena profundidad o resolución z, es popular en la microscopía moderna ya que permite la reconstrucción tridimensional de una muestra a partir de imágenes capturadas en diferentes planos focales.
En un microscopio ideal, solo la luz del plano focal podría llegar al detector (normalmente un observador o un CCD ), produciendo una imagen clara del plano de la muestra en la que se enfoca el microscopio. Desafortunadamente, un microscopio no es tan específico y la luz de fuentes fuera del plano focal también llega al detector; en una muestra gruesa puede haber una cantidad significativa de material y, por tanto, de señal espuria, entre el plano focal y la lente del objetivo .
Sin ninguna modificación en el microscopio, es decir, con un simple microscopio óptico de campo amplio , la calidad del corte óptico se rige por la misma física que el efecto de profundidad de campo en fotografía . Para una lente de apertura numérica alta , equivalente a una apertura amplia , la profundidad de campo es pequeña ( enfoque poco profundo ) y proporciona un buen seccionamiento óptico. Los objetivos de gran aumento suelen tener aperturas numéricas más altas (y, por tanto, un mejor seccionamiento óptico) que los objetivos de bajo aumento. Los objetivos de inmersión en aceite suelen tener aperturas numéricas aún mayores, por lo que se mejora el seccionamiento óptico.
La resolución en la dirección de profundidad (la "resolución z") de un microscopio de campo amplio estándar depende de la apertura numérica y la longitud de onda de la luz y se puede aproximar como:
donde λ es la longitud de onda, n el índice de refracción del medio de inmersión de la lente del objetivo y NA la apertura numérica. [2]
En comparación, la resolución lateral se puede aproximar como: [3]
Más allá del aumento de la apertura numérica, existen pocas técnicas disponibles para mejorar el seccionamiento óptico en microscopía de luz de campo brillante. La mayoría de los microscopios con objetivos de inmersión en aceite están alcanzando los límites de apertura numérica posibles debido a los límites de refracción .
El contraste de interferencia diferencial (DIC) proporciona mejoras modestas al seccionamiento óptico. En DIC, la muestra se ilumina efectivamente mediante dos fuentes de luz ligeramente desplazadas que luego interfieren para producir una imagen resultante de las diferencias de fase de las dos fuentes. Como el desplazamiento en las fuentes de luz es pequeño, la única diferencia de fase resulta del material cercano al plano focal.
En microscopía de fluorescencia, los objetos fuera del plano focal sólo interfieren con la imagen si están iluminados y son fluorescentes. Esto añade una forma adicional de mejorar el seccionamiento óptico al hacer que la iluminación sea específica únicamente del plano focal.
La microscopía confocal utiliza un punto de escaneo o puntos de luz para iluminar la muestra. Junto con un orificio en un plano focal conjugado, esto actúa para filtrar la luz de fuentes fuera del plano focal para mejorar el seccionamiento óptico. [4]
La microscopía de fluorescencia basada en lámina de luz ilumina la muestra con luz de excitación en un ángulo de 90° con respecto a la dirección de observación, es decir, solo se ilumina el plano focal utilizando un láser que solo se enfoca en una dirección (lámina de luz). [5] Este método reduce eficazmente la luz desenfocada y, además, puede conducir a una modesta mejora en la resolución longitudinal, en comparación con la microscopía de epifluorescencia.
Las técnicas de excitación dual y multifotónica aprovechan el hecho de que los fluoróforos pueden excitarse no sólo con un único fotón de la energía correcta , sino también con múltiples fotones, que juntos proporcionan la energía correcta. El efecto adicional dependiente de la " concentración " de requerir que múltiples fotones interactúen simultáneamente con un fluoróforo proporciona estimulación sólo muy cerca del plano focal. Estas técnicas se utilizan normalmente junto con la microscopía confocal. [6]
Se están desarrollando activamente otras mejoras en el seccionamiento óptico, que funcionan principalmente mediante métodos para eludir el límite de difracción de la luz. Los ejemplos incluyen la interferometría de fotón único a través de dos lentes objetivos para brindar información profunda extremadamente precisa sobre un solo fluoróforo [7] y la microscopía de iluminación estructurada tridimensional. [8]
El corte óptico de los microscopios normales de campo amplio se puede mejorar significativamente mediante la deconvolución , una técnica de procesamiento de imágenes para eliminar la borrosidad de la imagen según una función de dispersión de puntos medida o calculada . [9]
El seccionamiento óptico se puede mejorar mediante el uso de agentes limpiadores que posean un alto índice de refracción (>1,4), como el alcohol bencílico/benzoato de bencilo (BABB) o el éter bencílico [10] , que hacen que las muestras sean transparentes y, por lo tanto, permiten la observación de las estructuras internas. .
El seccionamiento óptico está poco desarrollado en microscopios no ópticos. [ cita necesaria ]
Los microscopios electrónicos y de rayos X suelen tener una gran profundidad de campo (sector óptico deficiente) y, por lo tanto, el corte fino de muestras todavía se utiliza ampliamente.
Aunque una física similar guía el proceso de enfoque, [11] Los microscopios de sonda de barrido y los microscopios electrónicos de barrido no suelen analizarse en el contexto del seccionamiento óptico, ya que estos microscopios solo interactúan con la superficie de la muestra.
La microscopía de reflexión interna total es una técnica de microscopía fluorescente que restringe intencionalmente la observación a las superficies superior o inferior de una muestra, pero con una resolución de profundidad extremadamente alta.
Se ha demostrado teórica y experimentalmente que las imágenes en 3D que utilizan una combinación de sección focal e inclinación pueden proporcionar una resolución 3D excepcional en grandes campos de visión. [12]
Las principales alternativas al seccionamiento óptico son:
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