La microscopía de reflexión interna total es una técnica de obtención de imágenes ópticas especializada para el seguimiento y la detección de objetos que utiliza la luz dispersada desde un campo evanescente en las proximidades de una interfaz dieléctrica . Sus ventajas son una alta relación señal-ruido y una alta resolución espacial en la dimensión vertical.
La reflexión interna total de la luz ocurre en la interfaz entre materiales con diferentes índices de refracción en ángulos de incidencia mayores que el ángulo crítico , , donde
y es el índice del medio incidente y el índice del medio de transmisión y se mide desde la normal a la interfaz.
En condiciones de reflexión interna total, el campo electromagnético en el medio de transmisión toma la forma de una onda evanescente , cuya intensidad decae exponencialmente con la distancia desde la interfaz de modo que,
Con fines prácticos, el medio de transmisión suele elegirse como fluido (normalmente agua) en el que se puede sumergir un objeto microscópico. Se espera que el objeto, al acercarse a la interfaz, disperse la luz de forma proporcional a la intensidad del campo a su altura, . [1] Dado que la profundidad de penetración del campo evanescente es del orden de cientos de nanómetros, esta técnica es una de las más sensibles para rastrear desplazamientos en la dirección perpendicular a una superficie. [2]
La delgada región de excitación de un campo evanescente permite obtener imágenes de campo amplio de un área de muestra seleccionada con una alta relación señal-ruido . Sin embargo, en lugar de depender de la dispersión óptica, a menudo se introducen fluoróforos en la muestra para una visualización más selectiva en aplicaciones biológicas. Esta popular técnica de obtención de imágenes se conoce como microscopía de fluorescencia de reflexión interna total .
Utilizando una onda evanescente calibrada, [1] se puede rastrear la posición de una partícula coloidal o una sonda microscópica con precisión nanométrica al monitorear la intensidad de la luz dispersada a través de la reflexión interna total frustrada . Luego se puede obtener la dinámica detallada de la sonda o partícula, ya sea en condiciones de equilibrio térmico o de no equilibrio.
Por ejemplo, al recopilar la distribución de probabilidad de posición independiente del tiempo de una partícula de sonda en equilibrio térmico e invertir la distribución de Maxwell-Boltzmann ,
donde es la función de partición y la constante de Boltzmann , se puede obtener el perfil de energía potencial de las interacciones entre la partícula y una superficie. [3] De esta manera, se pueden detectar fuerzas sub-picoNewton. [4]
Por otra parte, la dinámica difusiva de una célula o un coloide se puede deducir a partir de su posición en series temporales obtenidas mediante TIRM u otro método de seguimiento de partículas . De esta manera se han estudiado los efectos de acoplamiento hidrodinámico que resultan en una difusión reducida de una partícula en la proximidad de una interfaz sólida. [5]
