La espectroscopia de resonancia magnética nuclear , más comúnmente conocida como espectroscopia de RMN o espectroscopia de resonancia magnética ( MRS ), es una técnica espectroscópica basada en la reorientación de núcleos atómicos con espines nucleares distintos de cero en un campo magnético externo. Esta reorientación se produce con la absorción de radiación electromagnética en la región de radiofrecuencia de aproximadamente 4 a 900 MHz, que depende de la naturaleza isotópica del núcleo y aumenta proporcionalmente a la fuerza del campo magnético externo. [1] En particular, la frecuencia de resonancia de cada núcleo activo en RMN depende de su entorno químico. Como resultado, los espectros de RMN proporcionan información sobre los grupos funcionales individuales presentes en la muestra, así como sobre las conexiones entre núcleos cercanos en la misma molécula. Como los espectros de RMN son únicos o altamente característicos de compuestos individuales y grupos funcionales , la espectroscopia de RMN es uno de los métodos más importantes para identificar estructuras moleculares, particularmente de compuestos orgánicos .
El principio de la RMN suele implicar tres pasos secuenciales:
De manera similar, los bioquímicos utilizan la RMN para identificar proteínas y otras moléculas complejas. Además de la identificación, la espectroscopia de RMN proporciona información detallada sobre la estructura, la dinámica, el estado de reacción y el entorno químico de las moléculas. Los tipos más comunes de RMN son la espectroscopia de RMN de protones y carbono-13 , pero es aplicable a cualquier tipo de muestra que contenga núcleos que posean espín .
Los espectros de RMN son únicos, están bien resueltos, son analíticamente manejables y, a menudo, muy predecibles para moléculas pequeñas . Es evidente que se pueden distinguir diferentes grupos funcionales , y grupos funcionales idénticos con diferentes sustituyentes vecinos siguen dando señales distinguibles. La RMN ha reemplazado en gran medida las pruebas tradicionales de química húmeda , como los reactivos de color o la cromatografía típica para la identificación.
El inconveniente más importante de la espectroscopia de RMN es su escasa sensibilidad (en comparación con otros métodos analíticos, como la espectrometría de masas ). Por lo general, se requieren de 2 a 50 mg de una sustancia para registrar un espectro de RMN de calidad decente. El método de RMN no es destructivo, por lo que se puede recuperar la sustancia. Para obtener espectros de RMN de alta resolución, generalmente se disuelven sustancias sólidas para obtener soluciones líquidas, aunque también es posible la espectroscopia de RMN de estado sólido .
La escala de tiempo de la RMN es relativamente larga y, por tanto, no es adecuada para observar fenómenos rápidos, ya que produce sólo un espectro promediado. Aunque se muestran grandes cantidades de impurezas en un espectro de RMN, existen mejores métodos para detectar impurezas, ya que la RMN no es inherentemente muy sensible, aunque a frecuencias más altas, la sensibilidad es mayor.
La espectroscopia de correlación es un desarrollo de la RMN ordinaria. En RMN bidimensional , la emisión se centra alrededor de una única frecuencia y se observan resonancias correlacionadas. Esto permite identificar los sustituyentes vecinos del grupo funcional observado, permitiendo una identificación inequívoca de las resonancias. También existen métodos 3D y 4D más complejos y una variedad de métodos diseñados para suprimir o amplificar tipos particulares de resonancias. En la espectroscopia del efecto Overhauser nuclear (NOE), se observa la relajación de las resonancias. Como la NOE depende de la proximidad de los núcleos, la cuantificación de la NOE para cada núcleo permite la construcción de un modelo tridimensional de la molécula.
Los espectrómetros de RMN son relativamente caros; Las universidades suelen tenerlos, pero son menos comunes en las empresas privadas. Entre 2000 y 2015, un espectrómetro de RMN costó entre 500.000 y 5 millones de dólares . [3] [4] Los espectrómetros de RMN modernos tienen un imán superconductor enfriado con helio líquido muy fuerte, grande y costoso , porque la resolución depende directamente de la intensidad del campo magnético. Un campo magnético más alto también mejora la sensibilidad de la espectroscopia de RMN, que depende de la diferencia de población entre los dos niveles nucleares, que aumenta exponencialmente con la intensidad del campo magnético.
También hay disponibles máquinas menos costosas que utilizan imanes permanentes y de menor resolución, que aún ofrecen un rendimiento suficiente para determinadas aplicaciones, como la monitorización de reacciones y la comprobación rápida de muestras. Incluso existen espectrómetros de resonancia magnética nuclear de mesa . Los espectros de RMN de protones ( núcleos 1 H) se pueden observar incluso en el campo magnético de la Tierra . La RMN de baja resolución produce picos más amplios que pueden superponerse fácilmente entre sí, provocando problemas a la hora de resolver estructuras complejas. El uso de campos magnéticos de mayor intensidad da como resultado una mejor sensibilidad y una mayor resolución de los picos, y se prefiere con fines de investigación. [5]
El crédito por el descubrimiento de la RMN es de Isidor Isaac Rabi , quien recibió el Premio Nobel de Física en 1944. [6] El grupo Purcell de la Universidad de Harvard y el grupo Bloch de la Universidad de Stanford desarrollaron de forma independiente la espectroscopia de RMN a finales de los años 1940 y principios de los 1950. Edward Mills Purcell y Felix Bloch compartieron el Premio Nobel de Física de 1952 por sus inventos. [7]
El determinante clave de la actividad de RMN en los núcleos atómicos es el número cuántico de espín nuclear ( I ). Esta propiedad cuántica intrínseca, similar al " espín " de un átomo, caracteriza el momento angular del núcleo. Para ser activo en RMN, un núcleo debe tener un espín nuclear distinto de cero ( I ≠ 0). [8] Es este espín distinto de cero el que permite a los núcleos interactuar con campos magnéticos externos y mostrar señales en RMN. Los átomos con un número impar de protones y un número impar de neutrones, o una suma impar de protones y neutrones, exhiben valores semienteros para el número cuántico de espín nuclear ( I = 1/2, 3/2, 5/2, etcétera). Estos átomos son activos en RMN porque poseen un espín nuclear distinto de cero. Por el contrario, los átomos con un número par de protones y neutrones, o una suma par de protones y neutrones, tienen un número cuántico de espín nuclear igual a cero ( I = 0). Estos núcleos no exhiben espín activo y, por lo tanto, no son activos en RMN. [9] Los núcleos activos en RMN, particularmente aquellos con un número cuántico de espín de 1/2, son de gran importancia en la espectroscopia de RMN. Los ejemplos incluyen 1 H, 13 C, 15 N y 31 P. [10]
Cuando se colocan en un campo magnético, los núcleos activos de RMN (como el 1 H o el 13 C) absorben radiación electromagnética a una frecuencia característica del isótopo . [11] La frecuencia de resonancia, la energía de la radiación absorbida y la intensidad de la señal son proporcionales a la fuerza del campo magnético. Por ejemplo, en un campo magnético de 21 Tesla , los núcleos de hidrógeno (comúnmente denominados protones) resuenan a 900 MHz. Es común referirse a un imán de 21 T como un imán de 900 MHz ya que el hidrógeno es el núcleo más comúnmente detectado. Sin embargo, diferentes núcleos resonarán a diferentes frecuencias con esta intensidad de campo en proporción a sus momentos magnéticos nucleares . [ cita necesaria ]
Un espectrómetro de RMN generalmente consta de un soporte de muestra giratorio dentro de un imán muy fuerte, un emisor de radiofrecuencia y un receptor con una sonda (un conjunto de antena) que va dentro del imán para rodear la muestra, opcionalmente bobinas de gradiente para mediciones de difusión. y electrónica para controlar el sistema. Generalmente es necesario girar la muestra para promediar el movimiento de difusión; sin embargo, algunos experimentos requieren una muestra estacionaria cuando el movimiento de la solución es una variable importante. Por ejemplo, las mediciones de constantes de difusión ( espectroscopia ordenada por difusión o DOSY) [12] [13] se realizan utilizando una muestra estacionaria con escisión, y las celdas de flujo se pueden usar para el análisis en línea de los flujos de proceso.
La gran mayoría de las moléculas en una solución son moléculas de solvente, y la mayoría de los solventes regulares son hidrocarburos y, por lo tanto, contienen núcleos de hidrógeno-1 activos en RMN. Para evitar que las señales de los átomos de hidrógeno del disolvente abrumen el experimento e interfieran en el análisis del analito disuelto, se utilizan disolventes deuterados en los que más del 99% de los protones se reemplazan con deuterio (hidrógeno-2). [14] El disolvente deuterado más utilizado es el deuterocloroformo (CDCl 3 ), aunque se pueden utilizar otros disolventes por diversas razones, como la solubilidad de una muestra, el deseo de controlar los enlaces de hidrógeno o los puntos de fusión o ebullición. Los desplazamientos químicos de una molécula cambiarán ligeramente entre disolventes y, por lo tanto, el disolvente utilizado casi siempre se informará con desplazamientos químicos. [ cita necesaria ] Los espectros de RMN de protones a menudo se calibran con respecto al pico de protones residual del disolvente conocido [15] como estándar interno en lugar de agregar tetrametilsilano (TMS), que se define convencionalmente por tener un desplazamiento químico de cero. [dieciséis]
Para detectar los cambios de frecuencia muy pequeños debidos a la resonancia magnética nuclear, el campo magnético aplicado debe ser extremadamente uniforme en todo el volumen de la muestra. Los espectrómetros de RMN de alta resolución utilizan cuñas para ajustar la homogeneidad del campo magnético a partes por mil millones ( ppb ) en un volumen de unos pocos centímetros cúbicos. Para detectar y compensar la falta de homogeneidad y la deriva en el campo magnético, el espectrómetro mantiene un "bloqueo" en la frecuencia del deuterio del disolvente con una unidad de bloqueo separada, que es esencialmente un transmisor adicional y un procesador de RF sintonizado con el núcleo de bloqueo (deuterio). en lugar de los núcleos de la muestra de interés. [17] En los espectrómetros de RMN modernos, el calce se ajusta automáticamente, aunque en algunos casos el operador tiene que optimizar los parámetros del calce manualmente para obtener la mejor resolución posible. [18] [19]
Tras la excitación de la muestra con un pulso de radiofrecuencia (60–1000 MHz), se obtiene una respuesta de resonancia magnética nuclear: una desintegración por inducción libre (FID). Es una señal muy débil y requiere receptores de radio sensibles para captarla. Se lleva a cabo una transformada de Fourier para extraer el espectro en el dominio de la frecuencia del FID en el dominio del tiempo sin procesar. Un espectro de un solo FID tiene una relación señal-ruido baja , pero mejora fácilmente con el promedio de adquisiciones repetidas. Se pueden adquirir buenos espectros de 1H NMR con 16 repeticiones, lo que lleva sólo unos minutos. Sin embargo, para elementos más pesados que el hidrógeno, el tiempo de relajación es bastante largo, por ejemplo, alrededor de 8 segundos para 13 C. Por lo tanto, la adquisición de espectros cuantitativos de elementos pesados puede llevar mucho tiempo, desde decenas de minutos hasta horas. [ cita necesaria ]
Después del pulso, los núcleos se excitan, en promedio, hasta un cierto ángulo en comparación con el campo magnético del espectrómetro. El grado de excitación se puede controlar con la anchura del impulso, normalmente ca. 3-8 µs para el pulso óptimo de 90°. El ancho del pulso se puede determinar trazando la intensidad (con signo) en función del ancho del pulso. Sigue una curva sinusoidal y, en consecuencia, cambia de signo en anchos de pulso correspondientes a pulsos de 180° y 360°. [ cita necesaria ]
Los tiempos de desintegración de la excitación, normalmente medidos en segundos, dependen de la eficacia de la relajación, que es más rápida para núcleos más ligeros y en sólidos, y más lenta para núcleos más pesados y en soluciones, y puede ser muy larga en gases. Si el segundo pulso de excitación se envía prematuramente antes de que se complete la relajación, el vector de magnetización promedio no ha decaído al estado fundamental, lo que afecta la intensidad de la señal de una manera impredecible. En la práctica, las áreas de los picos no son proporcionales a la estequiometría; sólo es posible discernir la presencia, pero no la cantidad de grupos funcionales. Se puede realizar un experimento de recuperación de inversión para determinar el tiempo de relajación y, por tanto, el retraso requerido entre pulsos. Se transmite un pulso de 180°, un retardo ajustable y un pulso de 90°. Cuando el pulso de 90° anula exactamente la señal, el retraso corresponde al tiempo necesario para 90° de relajación. [20] La recuperación de la inversión vale la pena para experimentos cuantitativos de 13 C, 2D y otros experimentos que requieren mucho tiempo.
Las señales de RMN normalmente se caracterizan por tres variables: desplazamiento químico, acoplamiento espín-espín y tiempo de relajación.
La diferencia de energía, ΔE, entre los estados de espín nuclear es proporcional al campo magnético ( efecto Zeeman ). ΔE también es sensible al entorno electrónico del núcleo dando lugar a lo que se conoce como desplazamiento químico, δ. Los tipos más simples de gráficos de RMN son gráficos de los diferentes desplazamientos químicos de los núcleos que se estudian en la molécula. El valor de δ se expresa a menudo en términos de "blindaje": los núcleos blindados tienen un ΔE más alto. El rango de valores de δ se llama dispersión. Para señales de 1 H, la dispersión es bastante pequeña, pero para otros núcleos, la dispersión es mucho mayor. Las señales de RMN se informan en relación con una señal de referencia, generalmente la de TMS ( tetrametilsilano ). Además, dado que la distribución de las señales de RMN depende del campo, estas frecuencias se dividen por la frecuencia del espectrómetro. Sin embargo, como estamos dividiendo Hz por MHz, el número resultante sería demasiado pequeño y, por tanto, se multiplica por un millón. Por lo tanto, esta operación da un número de localización llamado "desplazamiento químico" con unidades de partes por millón. [21] El cambio químico proporciona información estructural.
La conversión de desplazamientos químicos (y J, ver más abajo) se llama asignación del espectro. Para compuestos orgánicos diamagnéticos, las asignaciones de espectros de RMN de 1H y 13C son extremadamente sofisticadas debido a las grandes bases de datos y las sencillas herramientas computacionales. En general, los desplazamientos químicos de los protones son muy predecibles, ya que están determinados principalmente por los efectos de protección (densidad electrónica). Los cambios químicos de muchos núcleos más pesados están más influenciados por otros factores, incluidos los estados excitados (contribución "paramagnética" al tensor de blindaje). Esta contribución paramagnética, que no está relacionada con el paramagnetismo , no sólo altera las tendencias en los desplazamientos químicos, lo que complica las asignaciones, sino que también da lugar a rangos de desplazamientos químicos muy grandes. Por ejemplo, la mayoría de las señales de 1H NMR para la mayoría de los compuestos orgánicos están dentro de 15 ppm. Para 31 P NMR, el rango es cientos de ppm. [22]
En la espectroscopia de RMN paramagnética , las muestras son paramagnéticas, es decir, contienen electrones desapareados. El paramagnetismo da lugar a desplazamientos químicos muy diversos. En la espectroscopia de RMN 1 H, el rango de desplazamiento químico puede abarcar hasta miles de ppm. [23]
Parte de la información más útil para la determinación de la estructura en un espectro de RMN unidimensional proviene del acoplamiento J o acoplamiento escalar (un caso especial de acoplamiento espín-espín) entre núcleos activos de RMN. Este acoplamiento surge de la interacción de diferentes estados de espín a través de los enlaces químicos de una molécula y da como resultado la división de las señales de RMN. Para un protón, el campo magnético local es ligeramente diferente dependiendo de si un núcleo adyacente apunta hacia o contra el campo magnético del espectrómetro, lo que da lugar a dos señales por protón en lugar de una. Estos patrones de división pueden ser complejos o simples y, de la misma manera, pueden ser directamente interpretables o engañosos. Este acoplamiento proporciona información detallada sobre la conectividad de los átomos en una molécula. [ cita necesaria ]
La multiplicidad de la división es un efecto de los espines de los núcleos que están acoplados y el número de dichos núcleos involucrados en el acoplamiento. El acoplamiento a n núcleos equivalentes (espín ½) divide la señal en un multiplete n +1 con relaciones de intensidad que siguen el triángulo de Pascal como se describe a la derecha. El acoplamiento a espines adicionales conducirá a más divisiones de cada componente del multiplete, por ejemplo, el acoplamiento a dos ½ núcleos de espín diferentes con constantes de acoplamiento significativamente diferentes conducirá a un doblete de dobletes (abreviatura: dd). Tenga en cuenta que el acoplamiento entre núcleos que son químicamente equivalentes (es decir, que tienen el mismo desplazamiento químico) no tiene ningún efecto en los espectros de RMN y los acoplamientos entre núcleos que están distantes (normalmente a más de 3 enlaces de diferencia para los protones en moléculas flexibles) suelen ser demasiado pequeños. para causar escisiones observables. A menudo se pueden observar acoplamientos de largo alcance en más de tres enlaces en compuestos cíclicos y aromáticos , lo que lleva a patrones de división más complejos. [ cita necesaria ]
Por ejemplo, en el espectro de protones del etanol descrito anteriormente, el grupo CH 3 se divide en un triplete con una relación de intensidad de 1:2:1 por los dos protones CH 2 vecinos . De manera similar, el CH 2 se divide en un cuarteto con una relación de intensidad de 1:3:3:1 por los tres protones del CH 3 vecinos . En principio, los dos protones CH 2 también se dividirían nuevamente en un doblete para formar un doblete de cuartetos por el protón hidroxilo, pero el intercambio intermolecular del protón hidroxilo ácido a menudo resulta en una pérdida de información de acoplamiento.
El acoplamiento a cualquier núcleo de espín 1/2, como fósforo-31 o flúor-19, funciona de esta manera (aunque las magnitudes de las constantes de acoplamiento pueden ser muy diferentes). Pero los patrones de división difieren de los descritos anteriormente para núcleos con espín mayor que ½ porque el número cuántico de espín tiene más de dos valores posibles. Por ejemplo, el acoplamiento al deuterio (un núcleo de espín 1) divide la señal en un triplete 1:1:1 porque el espín 1 tiene tres estados de espín. De manera similar, un núcleo de espín 3/2, como el 35 Cl, divide una señal en un cuarteto 1:1:1:1 y así sucesivamente.
El acoplamiento combinado con el desplazamiento químico (y la integración de los protones) nos informa no sólo sobre el entorno químico de los núcleos, sino también sobre el número de núcleos vecinos activos en RMN dentro de la molécula. En espectros más complejos con múltiples picos en desplazamientos químicos similares o en espectros de núcleos distintos del hidrógeno, el acoplamiento es a menudo la única forma de distinguir diferentes núcleos.
La magnitud del acoplamiento (la constante de acoplamiento, J ) es un efecto de la fuerza con la que los núcleos están acoplados entre sí. Para casos simples, esto es un efecto de la distancia de enlace entre los núcleos, el momento magnético de los núcleos y el ángulo diédrico entre ellos.
La descripción anterior supone que la constante de acoplamiento es pequeña en comparación con la diferencia en las frecuencias de RMN entre los espines no equivalentes. Si la separación de turnos disminuye (o la fuerza de acoplamiento aumenta), los patrones de intensidad múltiple primero se distorsionan y luego se vuelven más complejos y menos fáciles de analizar (especialmente si hay más de dos espines involucrados). La intensificación de algunos picos en un multiplete se logra a expensas del resto, que a veces casi desaparece en el ruido de fondo, aunque el área integrada bajo los picos permanece constante. Sin embargo, en la mayoría de las RMN de campo alto, las distorsiones suelen ser modestas y las distorsiones características ( techo ) pueden, de hecho, ayudar a identificar picos relacionados.
Algunos de estos patrones pueden analizarse con el método publicado por John Pople , [24] aunque tiene un alcance limitado.
Los efectos de segundo orden disminuyen a medida que aumenta la diferencia de frecuencia entre multipletes, de modo que los espectros de RMN de campo alto (es decir, de alta frecuencia) muestran menos distorsión que los espectros de frecuencia más baja. Los primeros espectros a 60 MHz eran más propensos a la distorsión que los espectros de máquinas posteriores que normalmente operaban a frecuencias de 200 MHz o superiores.
Además, como en la figura de la derecha, el acoplamiento en J se puede utilizar para identificar la sustitución orto-meta-para de un anillo. El ortoacoplamiento es el más fuerte a 15 Hz, le sigue Meta con un promedio de 2 Hz y, finalmente, el paraacoplamiento suele ser insignificante para los estudios.
Pueden ocurrir efectos más sutiles si espines químicamente equivalentes (es decir, núcleos relacionados por simetría y por tanto con la misma frecuencia de RMN) tienen diferentes relaciones de acoplamiento con espines externos. Los espines que son químicamente equivalentes pero que no son indistinguibles (según sus relaciones de acoplamiento) se denominan magnéticamente no equivalentes. Por ejemplo, los 4 sitios H del 1,2-diclorobenceno se dividen en dos pares químicamente equivalentes por simetría, pero un miembro individual de uno de los pares tiene diferentes acoplamientos con los espines que forman el otro par. La desigualdad magnética puede dar lugar a espectros muy complejos que sólo pueden analizarse mediante modelos computacionales. Tales efectos son más comunes en los espectros de RMN de sistemas aromáticos y otros sistemas no flexibles, mientras que el promedio conformacional sobre los enlaces C-C en moléculas flexibles tiende a igualar los acoplamientos entre protones en carbonos adyacentes, lo que reduce los problemas de desigualdad magnética.
La espectroscopia de correlación es uno de varios tipos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) bidimensional o RMN 2D . Este tipo de experimento de RMN es mejor conocido por su acrónimo COZY . Otros tipos de RMN bidimensional incluyen espectroscopia J, espectroscopia de intercambio (EXSY), espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY), espectroscopia de correlación total (TOCSY) y experimentos de correlación heteronuclear, como HSQC , HMQC y HMBC . En espectroscopia de correlación, la emisión se centra en el pico de un núcleo individual; Si su campo magnético está correlacionado con otro núcleo mediante enlace pasante (COSY, HSQC, etc.) o acoplamiento a través del espacio (NOE), también se puede detectar una respuesta en la frecuencia del núcleo correlacionado. Los espectros de RMN bidimensionales proporcionan más información sobre una molécula que los espectros de RMN unidimensionales y son especialmente útiles para determinar la estructura de una molécula , particularmente para moléculas con las que es demasiado complicado trabajar usando RMN unidimensional. El primer experimento bidimensional, COSY, fue propuesto por Jean Jeener, profesor de la Universidad Libre de Bruselas, en 1971. [25] [26] Este experimento fue implementado posteriormente por Walter P. Aue, Enrico Bartholdi y Richard R. Ernst. , quienes publicaron su trabajo en 1976. [27]
Diversas circunstancias físicas no permiten estudiar las moléculas en solución y, al mismo tiempo, tampoco mediante otras técnicas espectroscópicas a nivel atómico. En medios en fase sólida, como cristales, polvos microcristalinos, geles, soluciones anisotrópicas, etc., es en particular el acoplamiento dipolar y la anisotropía de desplazamiento químico los que se vuelven dominantes en el comportamiento de los sistemas de espín nuclear. En la espectroscopia de RMN en estado de solución convencional, estas interacciones adicionales conducirían a una ampliación significativa de las líneas espectrales. Una variedad de técnicas permiten establecer condiciones de alta resolución que pueden, al menos para los espectros de 13 C, ser comparables a los espectros de RMN en estado de solución.
Dos conceptos importantes para la espectroscopia de RMN de estado sólido de alta resolución son la limitación de la posible orientación molecular mediante la orientación de la muestra y la reducción de las interacciones magnéticas nucleares anisotrópicas mediante el giro de la muestra. De este último enfoque, el giro rápido alrededor del ángulo mágico es un método muy destacado, cuando el sistema comprende 1/2 núcleos de espín. Tasas de hilatura de ca. Se utilizan 20 kHz, lo que exige un equipamiento especial. Actualmente se están utilizando en espectroscopia de RMN varias técnicas intermedias, con muestras de alineamiento parcial o movilidad reducida.
Las aplicaciones en las que se producen efectos de RMN en estado sólido suelen estar relacionadas con investigaciones estructurales en proteínas de membrana, fibrillas de proteínas o todo tipo de polímeros, y análisis químicos en química inorgánica, pero también incluyen aplicaciones "exóticas" como las hojas de las plantas y las pilas de combustible. Por ejemplo, Rahmani et al. estudió el efecto de la presión y la temperatura en el autoensamblaje de las estructuras bicelares mediante espectroscopia de RMN de deuterio. [29]
Gran parte de la innovación dentro de la espectroscopia de RMN se ha producido en el campo de la espectroscopia de RMN de proteínas , una técnica importante en biología estructural . Un objetivo común de estas investigaciones es obtener estructuras tridimensionales de alta resolución de la proteína, similar a lo que se puede lograr mediante cristalografía de rayos X. A diferencia de la cristalografía de rayos X, la espectroscopia de RMN suele limitarse a proteínas de menos de 35 kDa , aunque se han resuelto estructuras más grandes. La espectroscopia de RMN es a menudo la única manera de obtener información de alta resolución sobre proteínas parcial o totalmente intrínsecamente desestructuradas . Ahora es una herramienta común para la determinación de las relaciones de actividad de configuración donde la estructura antes y después de la interacción con, por ejemplo, un fármaco candidato se compara con su actividad bioquímica conocida. Las proteínas son órdenes de magnitud más grandes que las pequeñas moléculas orgánicas analizadas anteriormente en este artículo, pero también se aplican las técnicas básicas de RMN y parte de la teoría de RMN. Debido al número mucho mayor de átomos presentes en una molécula de proteína en comparación con un compuesto orgánico pequeño, los espectros 1D básicos se llenan de señales superpuestas hasta tal punto que el análisis espectral directo se vuelve insostenible. Por ello, se han ideado experimentos multidimensionales (2, 3 o 4D) para abordar este problema. Para facilitar estos experimentos, es deseable marcar isotópicamente la proteína con 13 C y 15 N porque el isótopo predominante de origen natural 12 C no es activo en RMN y el momento cuadrupolar nuclear del isótopo predominante de origen natural 14 N impide que se obtenga información de alta resolución. obteniéndose de este isótopo de nitrógeno. El método más importante utilizado para la determinación de la estructura de proteínas utiliza experimentos NOE para medir distancias entre átomos dentro de la molécula. Posteriormente, las distancias obtenidas se utilizan para generar una estructura 3D de la molécula resolviendo un problema de geometría de distancias . La RMN también se puede utilizar para obtener información sobre la dinámica y la flexibilidad conformacional de diferentes regiones de una proteína.
La RMN de ácidos nucleicos es el uso de espectroscopía de RMN para obtener información sobre la estructura y dinámica de los ácidos polinucleicos , como el ADN o el ARN . En 2003 [actualizar], casi la mitad de todas las estructuras de ARN conocidas se habían determinado mediante espectroscopia de RMN. [30]
La espectroscopia de RMN de ácidos nucleicos y proteínas es similar pero existen diferencias. Los ácidos nucleicos tienen un porcentaje menor de átomos de hidrógeno, que son los átomos que normalmente se observan en la espectroscopia de RMN, y debido a que las dobles hélices de los ácidos nucleicos son rígidas y aproximadamente lineales, no se pliegan sobre sí mismas para dar correlaciones de "largo alcance". [31] Los tipos de RMN que generalmente se realizan con ácidos nucleicos son RMN de 1H o de protones , RMN de 13C , RMN de 15N y RMN de 31P . Casi siempre se utilizan métodos de RMN bidimensionales , como la espectroscopia de correlación (COSY) y la espectroscopia de transferencia de coherencia total (TOCSY) para detectar acoplamientos nucleares a través de enlaces, y la espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) para detectar acoplamientos entre núcleos que están cerca de unos a otros en el espacio. [32]
Los parámetros tomados del espectro, principalmente picos cruzados NOESY y constantes de acoplamiento , se pueden usar para determinar características estructurales locales como ángulos de enlace glicosídico , ángulos diédricos (usando la ecuación de Karplus ) y conformaciones de fruncidos de azúcar. Para una estructura a gran escala, estos parámetros locales deben complementarse con otras suposiciones o modelos estructurales, porque los errores se acumulan a medida que se atraviesa la doble hélice y, a diferencia de las proteínas, la doble hélice no tiene un interior compacto y no se pliega hacia atrás. sí mismo. La RMN también es útil para investigar geometrías no estándar, como hélices dobladas , pares de bases no Watson-Crick y apilamiento coaxial . Ha sido especialmente útil para sondear la estructura de los oligonucleótidos de ARN naturales, que tienden a adoptar conformaciones complejas como tallo-bucles y pseudonudos . La RMN también es útil para investigar la unión de moléculas de ácido nucleico a otras moléculas, como proteínas o fármacos, al ver qué resonancias se desplazan al unirse la otra molécula. [32]
La espectroscopia de RMN de carbohidratos aborda cuestiones sobre la estructura y conformación de los carbohidratos . El análisis de carbohidratos mediante 1H NMR es un desafío debido a la variación limitada en los grupos funcionales, lo que conduce a resonancias 1H concentradas en bandas estrechas del espectro de NMR. En otras palabras, existe una pobre dispersión espectral. Las resonancias de protones anoméricos están segregadas de las demás debido a que los carbonos anoméricos llevan dos átomos de oxígeno. Para carbohidratos más pequeños, la dispersión de las resonancias de protones anoméricos facilita el uso de experimentos 1D TOCSY para investigar todos los sistemas de espín de residuos de carbohidratos individuales.
El conocimiento de los mínimos de energía y las barreras de energía rotacional de moléculas pequeñas en solución se puede obtener mediante RMN, por ejemplo, observando las preferencias conformacionales de los ligandos libres y la dinámica conformacional, respectivamente. Esto se puede utilizar para guiar las hipótesis de diseño de fármacos, ya que los valores experimentales y calculados son comparables. Por ejemplo, AstraZeneca utiliza la RMN para su investigación y desarrollo en oncología. [33]
Uno de los primeros trabajos científicos dedicados al uso de la presión como parámetro variable en experimentos de RMN fue el trabajo de J. Jonas publicado en la revista Annual Review of Biophysics en 1994. [34] El uso de altas presiones en la espectroscopia de RMN fue principalmente impulsado por el deseo de estudiar sistemas bioquímicos, donde el uso de alta presión permite cambios controlados en las interacciones intermoleculares sin perturbaciones significativas.
Por supuesto, se han hecho intentos de resolver problemas científicos utilizando espectroscopia de RMN de alta presión. Sin embargo, la mayoría de ellos fueron difíciles de reproducir debido al problema de los equipos para crear y mantener alta presión. En [35] [36] [37] se dan los tipos más comunes de células de RMN para la realización de experimentos de RMN de alta presión.
Hasta la fecha, la espectroscopia de RMN de alta presión se ha utilizado ampliamente para una variedad de aplicaciones, principalmente relacionadas con la caracterización de la estructura de moléculas de proteínas. [38] [39] Sin embargo, en los últimos años, se han propuesto soluciones de diseño y software para caracterizar las estructuras químicas y espaciales de moléculas pequeñas en un entorno de fluido supercrítico, [40] utilizando parámetros de estado como fuerza impulsora para tales cambios. [41]
Métodos relacionados de espectroscopia nuclear :
