La RMN de ácidos nucleicos es el uso de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear para obtener información sobre la estructura y dinámica de las moléculas de ácidos nucleicos , como el ADN o el ARN . Es útil para moléculas de hasta 100 nucleótidos y, en 2003, casi la mitad de todas las estructuras de ARN conocidas se habían determinado mediante espectroscopia de RMN. [1]
La RMN tiene ventajas sobre la cristalografía de rayos X , que es el otro método para la determinación de la estructura de ácidos nucleicos de alta resolución , ya que las moléculas se observan en su estado de solución natural en lugar de en una red cristalina que puede afectar las propiedades estructurales de la molécula. También es posible investigar la dinámica con RMN. Esto se produce a costa de estructuras ligeramente menos precisas y detalladas que la cristalografía. [2]
La RMN de ácidos nucleicos utiliza técnicas similares a las de la RMN de proteínas , pero tiene varias diferencias. Los ácidos nucleicos tienen un porcentaje menor de átomos de hidrógeno, que son los átomos que se observan habitualmente en la RMN, y debido a que las dobles hélices de los ácidos nucleicos son rígidas y aproximadamente lineales, no se pliegan sobre sí mismas para dar correlaciones de "largo alcance". Los ácidos nucleicos también tienden a tener resonancias distribuidas en un rango más pequeño que las proteínas, lo que hace que los espectros sean potencialmente más concurridos y difíciles de interpretar. [3]
Los métodos de RMN bidimensionales se utilizan casi siempre con ácidos nucleicos. Estos incluyen la espectroscopia de correlación (COSY) y la espectroscopia de transferencia de coherencia total (TOCSY) para detectar acoplamientos nucleares a través de enlaces, y la espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) para detectar acoplamientos entre núcleos que están cerca uno del otro en el espacio. Los tipos de RMN que se realizan habitualmente con ácidos nucleicos son 1 H RMN , 13 C RMN , 15 N RMN y 31 P RMN . La RMN 19 F también es útil si se incorporan nucleótidos no naturales como 2'-fluoro-2'-desoxiadenosina en la cadena de ácido nucleico, ya que los ácidos nucleicos naturales no contienen ningún átomo de flúor. [2] [4]
1 H y 31 P tienen una abundancia natural cercana al 100% , mientras que 13 C y 15 N tienen abundancias naturales bajas. Para estos dos últimos núcleos, existe la capacidad de enriquecer isotópicamente los átomos deseados dentro de las moléculas, ya sea de manera uniforme o de manera específica del sitio. Los nucleótidos enriquecidos uniformemente en 13 C y/o 15 N se pueden obtener a través de métodos bioquímicos, realizando una reacción en cadena de la polimerasa utilizando dNTP o NTP derivados de bacterias cultivadas en un entorno enriquecido isotópicamente. El enriquecimiento isotópico específico del sitio debe realizarse a través de la síntesis química del monómero de fosforamidita de nucleósido marcado y de la cadena completa ; sin embargo, estos son difíciles y costosos de sintetizar. [1] [5]
Debido a que los ácidos nucleicos tienen una cantidad relativamente grande de protones que son intercambiables con el solvente, la RMN de ácidos nucleicos generalmente no se realiza en el solvente D2O como es común con otros tipos de RMN. Esto se debe a que el deuterio en el solvente reemplazaría a los protones intercambiables y extinguiría su señal. Se utiliza H2O como solvente y se utilizan otros métodos para eliminar la fuerte señal del solvente, como saturar la señal del solvente antes de la secuencia de pulsos normal ("presaturación"), que funciona mejor a baja temperatura para evitar el intercambio de los protones del solvente saturado con los protones del ácido nucleico; o excitar solo las resonancias de interés ("excitación selectiva"), que tiene el efecto adicional, potencialmente no deseado, de distorsionar las amplitudes de pico. [2]
Los protones intercambiables y no intercambiables se asignan generalmente a sus picos específicos como dos grupos independientes. Para los protones intercambiables, que son en su mayor parte los protones involucrados en el apareamiento de bases , NOESY se puede utilizar para encontrar correlaciones a través del espacio entre bases vecinas, lo que permite asignar una molécula dúplex completa a través del recorrido secuencial . Para los protones no intercambiables, muchos de los cuales están en la fracción de azúcar del ácido nucleico, COSY y TOCSY se utilizan para identificar sistemas de núcleos acoplados, mientras que NOESY se utiliza nuevamente para correlacionar el azúcar con la base y cada base con su base vecina. Para los protones no intercambiables del ADN dúplex, los protones H6/H8 en la base se correlacionan con sus contrapartes en las bases vecinas y con el protón H1' en el azúcar, lo que permite realizar el recorrido secuencial. Para el ARN, las diferencias en la estructura química y la geometría de la hélice hacen que esta asignación sea más difícil técnicamente, pero aún posible. La metodología de caminata secuencial no es posible para estructuras de ácidos nucleicos que no sean de doble hélice, ni para la forma Z-ADN , lo que dificulta la asignación de resonancias. [2] [3]
Los parámetros tomados del espectro, principalmente los picos cruzados NOESY y las constantes de acoplamiento , se pueden utilizar para determinar características estructurales locales como los ángulos de enlace glucosídico , los ángulos diedros (utilizando la ecuación de Karplus ) y las conformaciones de fruncido de azúcar. La presencia o ausencia de resonancias de protones imino, o de acoplamiento entre átomos de 15 N a través de un enlace de hidrógeno, indica la presencia o ausencia de apareamiento de bases. Para la estructura a gran escala, estos parámetros locales deben complementarse con otras suposiciones o modelos estructurales, porque los errores se acumulan a medida que se recorre la doble hélice y, a diferencia de las proteínas, la doble hélice no tiene un interior compacto y no se pliega sobre sí misma. Sin embargo, se puede obtener información de orientación de largo alcance a través de experimentos de acoplamiento dipolar residual en un medio que impone una alineación débil en las moléculas de ácido nucleico. [1] [2]
Recientemente, se ha introducido la metodología de RMN de estado sólido para la determinación de la estructura de los ácidos nucleicos. [6] El protocolo implica dos enfoques: etiquetado selectivo de tipo nucleótido del ARN y uso de experimentos de correlación heteronuclear.
La RMN también es útil para investigar geometrías no estándar como hélices dobladas , pares de bases que no son de Watson-Crick y apilamiento coaxial . Ha sido especialmente útil para investigar la estructura de oligonucleótidos de ARN naturales, que tienden a adoptar conformaciones complejas como bucles de tallo y pseudonudos . Las interacciones entre el ARN y los iones metálicos se pueden investigar mediante varios métodos, incluida la observación de cambios en el desplazamiento químico tras la unión de iones, la observación del ensanchamiento de líneas para especies de iones paramagnéticos y la observación de contactos NOE intermoleculares para imitadores organometálicos de los iones metálicos. La RMN también es útil para investigar la unión de moléculas de ácido nucleico a otras moléculas, como proteínas o fármacos. Esto se puede hacer mediante el mapeo del desplazamiento químico, que consiste en ver qué resonancias se desplazan tras la unión de la otra molécula, o mediante experimentos de saturación cruzada en los que una de las moléculas de unión se satura selectivamente y, si se une, la saturación se transfiere a la otra molécula del complejo. [1] [2]
Las propiedades dinámicas, como los equilibrios de cadena simple y dúplex, y las tasas de unión de otras moléculas a los dúplex también se pueden determinar por su efecto en el tiempo de relajación de espín-red T 1 , pero estos métodos son insensibles a tasas intermedias de 10 4 –10 8 s −1 , que deben investigarse con otros métodos, como la RMN de estado sólido . La dinámica de las propiedades mecánicas de una doble hélice de ácido nucleico, como la flexión y la torsión, también se puede estudiar mediante RMN. Los experimentos de RMN de gradiente de campo pulsado se pueden utilizar para medir las constantes de difusión . [1] [2] [7]
Los estudios de RMN de ácidos nucleicos se realizaron ya en 1971 [8] y se centraron en el uso de las resonancias de protones imino de campo bajo para investigar las interacciones de apareamiento de bases. Estos primeros estudios se centraron en el ARNt porque estos ácidos nucleicos eran las únicas muestras disponibles en ese momento con un peso molecular lo suficientemente bajo como para que los anchos de línea espectrales de RMN fueran prácticos. El estudio se centró en los protones de campo bajo porque eran los únicos protones que se podían observar de forma fiable en solución acuosa utilizando los mejores espectrómetros disponibles en ese momento. Rápidamente se advirtió que los espectros de los protones imino de campo bajo proporcionaban pistas sobre la estructura terciaria del ARNt en solución. El primer espectro de RMN de un ADN de doble hélice se publicó en 1977 [9] utilizando una doble hélice sintética de 30 pares de bases. Para superar el ensanchamiento severo de línea en el ADN nativo, se preparó ADN natural degradado puro y se estudió para aprender sobre la longitud de persistencia del ADN de doble hélice. [10] Al mismo tiempo, se estudiaron las partículas del núcleo del nucleosoma para obtener más información sobre la flexibilidad de la doble hélice. [11] Los primeros espectros de RMN informados para un ADN de secuencia nativa de bajo peso molecular uniforme, elaborado con enzimas de restricción , se informaron en 1981. [12] Este trabajo también fue el primer informe de espectros de RMN de ácidos nucleicos obtenidos en campo alto. Los estudios de RMN bidimensionales comenzaron a informarse en 1982 [13] y luego, con el advenimiento de la síntesis de oligonucleótidos y una instrumentación más sofisticada, se informaron muchos estudios estructurales detallados a partir de 1983. [14]