Los experimentos de triple resonancia son un conjunto de experimentos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) multidimensionales que vinculan tres tipos de núcleos atómicos , que generalmente consisten en 1 H, 15 N y 13 C. Estos experimentos se utilizan a menudo para asignar señales de resonancia específicas a átomos específicos en una proteína enriquecida isotópicamente. La técnica fue descrita por primera vez en artículos de Ad Bax , Mitsuhiko Ikura y Lewis Kay en 1990, [1] [2] y luego se agregaron más experimentos al conjunto de experimentos. Muchos de estos experimentos se han convertido desde entonces en el conjunto estándar de experimentos utilizados para la asignación secuencial de resonancias de RMN en la determinación de la estructura de proteínas por RMN . Ahora son una parte integral del estudio de RMN en solución de proteínas, y también pueden usarse en RMN de estado sólido . [3] [4]
Existen dos métodos principales para determinar la estructura de las proteínas a nivel atómico. El primero de ellos es la cristalografía de rayos X , que comenzó en 1958, cuando se determinó la estructura cristalina de la mioglobina . El segundo método es la RMN, que comenzó en la década de 1980, cuando Kurt Wüthrich describió el marco para la determinación de la estructura de las proteínas por RMN y resolvió la estructura de las proteínas globulares pequeñas. [5] El primer método de determinación estructural de las proteínas por RMN se basaba en la espectroscopia de RMN homonuclear basada en protones, en la que el tamaño de la proteína que se puede determinar está limitado a ~10 KDa. Esta limitación se debe a la necesidad de asignar señales de RMN a partir de la gran cantidad de núcleos de la proteína: en proteínas más grandes, la mayor cantidad de núcleos da como resultado una sobrepoblación de resonancias, y el aumento del tamaño de la proteína también amplía las señales, lo que dificulta la asignación de resonancias. Estos problemas pueden aliviarse mediante el uso de espectroscopia de RMN heteronuclear que permite editar el espectro de protones con respecto a los desplazamientos químicos de 15 N y 13 C , y también reduce la superposición de resonancias al aumentar el número de dimensiones del espectro. En 1990, Ad Bax y colaboradores desarrollaron la tecnología de triple resonancia y experimentos en proteínas marcadas isotópicamente con 15 N y 13 C, [1] con el resultado de que los espectros se simplifican drásticamente, facilitando en gran medida el proceso de asignación de resonancia y aumentando el tamaño de la proteína que puede determinarse por RMN.
Estos experimentos de triple resonancia utilizan los acoplamientos magnéticos relativamente grandes entre ciertos pares de núcleos para establecer su conectividad. Específicamente, los acoplamientos 1 J NH , 1 J CH , 1 J CC y 1 J CN se utilizan para establecer la vía de conectividad escalar entre núcleos. El proceso de transferencia de magnetización se lleva a cabo a través de múltiples y eficientes pasos de transferencia de magnetización de un enlace, en lugar de un solo paso a través de los acoplamientos 3 J HH más pequeños y variables . El tamaño relativamente grande y la buena uniformidad de los acoplamientos de un enlace permitieron el diseño de esquemas de transferencia de magnetización eficientes que son efectivamente uniformes en una proteína dada, casi independientemente de la conformación. [3] Los experimentos de triple resonancia que involucran 31 P también pueden usarse para estudios de ácidos nucleicos. [6]
Estos experimentos suelen recibir su nombre por los núcleos (H, N y C) que intervienen en el experimento. CO se refiere al carbono carbonílico , mientras que CA y CB se refieren a Cα y Cβ respectivamente, de forma similar HA y HB para Hα y Hβ (consulte el diagrama para ver ejemplos de experimentos). Los núcleos en el nombre están ordenados en la misma secuencia que en la ruta de transferencia de magnetización; los núcleos colocados entre paréntesis participan en la ruta de transferencia de magnetización, pero no se registran. Por razones de sensibilidad, estos experimentos generalmente comienzan en un protón y terminan en un protón, generalmente a través de pasos INEPT e INEPT inverso. Por lo tanto, muchos de estos experimentos son lo que se puede llamar experimentos de "ida y vuelta" en los que, aunque no se indica en el nombre, la magnetización se transfiere de nuevo al protón de partida para la adquisición de la señal.
Algunos de los experimentos se utilizan en tándem para la asignación de resonancia de proteínas; por ejemplo, HNCACB puede utilizarse junto con CBCA(CO)NH como un par de experimentos. No es necesario registrar todos estos experimentos para la asignación secuencial (se puede hacer con tan solo dos), sin embargo, los pares de experimentos adicionales son útiles para la evaluación independiente de la exactitud de la asignación, y la redundancia de información puede ser necesaria cuando hay ambigüedad en las asignaciones. También son necesarios otros experimentos para asignar completamente las resonancias de la cadena lateral.
Existen versiones TROSY de muchos de estos experimentos para mejorar la sensibilidad. [7] Los experimentos de triple resonancia también se pueden utilizar en la asignación de resonancia de cadena principal específica de secuencia de espectros de RMN de giro de ángulo mágico en RMN de estado sólido . [4] [8]
Se han creado un gran número de experimentos de RMN de triple resonancia y los experimentos enumerados a continuación no pretenden ser exhaustivos.
El experimento proporciona las conectividades entre la amida de un residuo con el carbono carbonílico de los residuos precedentes. [2] Es el más sensible de los experimentos de triple resonancia. Las cadenas laterales carboxamidas de asparagina y glutamina también son visibles en este experimento. Además, el grupo guanidino de la arginina , que tiene una constante de acoplamiento similar al grupo carboxamida, también puede aparecer en este espectro. Este experimento a veces se utiliza junto con HN(CA)CO.
En este caso, la resonancia de amida de un residuo se correlaciona con el carbono carbonílico del mismo residuo, así como con el del residuo precedente. Las resonancias intraresiduo suelen ser más fuertes que las interresiduos. [9]
Este experimento correlaciona las resonancias de la amida de un residuo con el Cα del residuo precedente. Este experimento se utiliza a menudo junto con HNCA. [10]
Este experimento correlaciona el desplazamiento químico de la amida de un residuo con el Cα del mismo residuo, así como con los del residuo anterior. [2] Cada tira da dos picos, los picos Cα inter e intraresiduo. El pico del Cα anterior se puede identificar a partir del experimento HN(CO)CA, que da solo el Cα interresiduo.
CBCA(CO)NH, o alternativamente HN(CO)CACB, correlaciona las resonancias de la amida de un residuo con el Cα y Cβ del residuo precedente. [11] Por lo tanto, son visibles dos picos correspondientes al Cα y Cβ para cada residuo. Este experimento se utiliza normalmente junto con HNCACB. La carboxamida de la cadena lateral de glutaminas y asparaginas también aparece en estos espectros en este experimento. CBCA(CO)NH a veces se llama con más precisión (HBHA)CBCA(CO)NH ya que comienza con protones alifáticos y termina en un protón amida y, por lo tanto, no es un experimento de ida y vuelta como HN(CO)CACB.
HNCACB, o alternativamente CBCANH, correlaciona el desplazamiento químico de la amida de un residuo con el Cα y el Cβ del mismo residuo, así como los del residuo precedente. [12] En cada tira, pueden verse cuatro picos: 2 del mismo residuo y 2 del residuo precedente. Los picos del residuo precedente suelen ser más débiles y pueden identificarse utilizando CBCA(CO)NH. En este experimento, los picos Cα y Cβ están en fase opuesta, es decir, si Cα aparece como un pico positivo, entonces Cβ será negativo, lo que hace que la identificación de Cα y Cβ sea sencilla. La información adicional de Cβ del conjunto de experimentos CBCA(CO)NH/HNCACB hace que la identificación del tipo de residuo sea más fácil que con HN(CO)CA/HNCA, sin embargo, el HNCACB es un experimento menos sensible y puede no ser adecuado para algunas proteínas.
El experimento CBCANH es menos adecuado para proteínas más grandes, ya que es más susceptible al problema del ancho de línea que HNCACB.
Este experimento proporciona las conectividades entre Cα y Cβ con los átomos de carbono carbonilo y Hα dentro del mismo residuo. [13] El grupo carboxilo de la cadena lateral del aspartato y el glutamato puede aparecer débilmente en este espectro.
Este experimento proporciona conectividades entre la amida de un residuo y los átomos de carbono alifáticos del residuo precedente. [14]
Este experimento proporciona conectividades entre la amida de un residuo y los átomos de hidrógeno unidos al carbono alifático del residuo anterior.
Este experimento correlaciona la resonancia de amida con Hα y Hβ del residuo precedente. [15]
Los pares de experimentos se utilizan normalmente para la asignación secuencial, por ejemplo, el par HNCACB y CBCA(CO)NH, o HNCA y HNC(CO)CA. Los espectros se analizan normalmente como tiras de picos, y las tiras del par de experimentos se pueden presentar juntas una al lado de la otra o como una superposición de dos espectros. En los espectros HNCACB, normalmente hay 4 picos presentes en cada tira, el Cα y Cβ de un residuo, así como los de su residuo precedente. Los picos del residuo precedente se pueden identificar a partir del experimento CBCA(CO)NH. Por lo tanto, cada tira de picos se puede vincular a la siguiente tira de picos de un residuo adyacente, lo que permite que las tiras se conecten secuencialmente. El tipo de residuo se puede identificar a partir de los desplazamientos químicos de los picos; algunos, como la serina, la treonina, la glicina y la alanina, son mucho más fáciles de identificar que otros. Las resonancias pueden luego asignarse comparando la secuencia de picos con la secuencia de aminoácidos de la proteína.
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