La respuesta hipersensible ( HR ) es un mecanismo utilizado por las plantas para prevenir la propagación de infecciones por patógenos microbianos . La HR se caracteriza por la muerte rápida de células en la región local que rodea una infección y sirve para restringir el crecimiento y la propagación de patógenos a otras partes de la planta. Es análogo al sistema inmunológico innato que se encuentra en los animales y comúnmente precede a una respuesta sistémica (de toda la planta) más lenta, que en última instancia conduce a una resistencia sistémica adquirida (SAR). [1] La HR se puede observar en la gran mayoría de especies de plantas y es inducida por una amplia gama de patógenos vegetales como oomicetos , virus , hongos e incluso insectos. [2]
Comúnmente se piensa que la HR es una estrategia de defensa eficaz contra los patógenos biotróficos de las plantas , que requieren tejido vivo para obtener nutrientes . En el caso de patógenos necrotróficos , la HR podría incluso ser beneficiosa para el patógeno , ya que requiere células vegetales muertas para obtener nutrientes . La situación se complica cuando se consideran patógenos como Phytophthora infestans , que en las etapas iniciales de la infección actúan como biotrofos pero luego cambian a un estilo de vida necrotrófico. Se propone que en este caso la HR podría ser beneficiosa en las primeras etapas de la infección pero no en las últimas. [3]
La primera idea de cómo se produce la respuesta hipersensible provino del modelo gen por gen de Harold Henry Flor . Postuló que por cada gen de resistencia (R) codificado por la planta, existe un gen de avirulencia (Avr) correspondiente codificado por el microbio . La planta es resistente al patógeno si tanto el gen Avr como el R están presentes durante la interacción planta-patógeno. [4] Los genes que participan en las interacciones entre plantas y patógenos tienden a evolucionar a un ritmo muy rápido. [5]
Muy a menudo, la resistencia mediada por los genes R se debe a que estos inducen HR, lo que conduce a la apoptosis . La mayoría de los genes R de las plantas codifican proteínas del receptor tipo NOD (NLR) . [6] La arquitectura del dominio de la proteína NLR consiste en un dominio NB-ARC que es un dominio de unión a nucleótidos , responsable de los cambios conformacionales asociados con la activación de la proteína NLR . En la forma inactiva, el dominio NB-ARC está unido al difosfato de adenosina (ADP). Cuando se detecta un patógeno , el ADP se intercambia por trifosfato de adenosina (ATP) y esto induce un cambio conformacional en la proteína NLR , que da como resultado HR. En el extremo N, el NLR tiene un dominio del receptor de interleucina de peaje (TIR) (que también se encuentra en los receptores de peaje de los mamíferos ) o un motivo de bobina en espiral (CC). Tanto el dominio TIR como el CC están implicados en causar la muerte celular durante la FC. El extremo C de los NLR consiste en un motivo repetido rico en leucina (LRR), que participa en la detección de los factores de virulencia del patógeno . [7]
La planta activa la HR cuando reconoce un patógeno . La identificación de un patógeno ocurre típicamente cuando un producto de un gen de virulencia , secretado por un patógeno , se une o interactúa indirectamente con el producto de un gen R de una planta . Los genes R son altamente polimórficos y muchas plantas producen varios tipos diferentes de productos del gen R , lo que les permite reconocer productos de virulencia producidos por muchos patógenos diferentes . [8]
En la fase uno de la HR, la activación de los genes R desencadena un flujo de iones , que implica una salida de hidróxido y potasio hacia el exterior de las células, y una entrada de iones de calcio e hidrógeno hacia el interior de las células. [9]
En la fase dos, las células implicadas en la FC generan un estallido oxidativo al producir especies reactivas de oxígeno (ROS), aniones superóxido , peróxido de hidrógeno , radicales hidroxilo y óxido nitroso . Estos compuestos afectan la función de la membrana celular , en parte al inducir la peroxidación lipídica y al causar daño a los lípidos. [9]
La alteración de los componentes iónicos en la célula y la degradación de los componentes celulares en presencia de ROS resultan en la muerte de las células afectadas, así como en la formación de lesiones locales . Las especies reactivas de oxígeno también desencadenan la deposición de lignina y callosa , así como el entrecruzamiento de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina preformadas , como la P33, con la matriz de la pared a través de la tirosina en el motivo PPPPY. [9] Estos compuestos sirven para reforzar las paredes de las células que rodean la infección, creando una barrera e inhibiendo la propagación de la infección. [10] La activación de la FC también produce alteraciones del citoesqueleto, la función mitocondrial y cambios metabólicos, todos los cuales podrían estar implicados en la muerte celular. [11] [12] [13]
Los RR.HH. se pueden activar de dos formas principales: directa e indirectamente. La unión directa de los factores de virulencia a los NLR puede dar como resultado la activación de HR. Sin embargo, esto parece ser bastante raro. Más comúnmente, los factores de virulencia se dirigen a ciertas proteínas celulares que modifican y luego los NLR detectan esta modificación. El reconocimiento indirecto parece ser más común ya que múltiples factores de virulencia pueden modificar la misma proteína celular con las mismas modificaciones, permitiendo así que un receptor reconozca múltiples factores de virulencia . [14] A veces, los dominios proteicos a los que se dirigen los factores de virulencia se integran en los NLR. Un ejemplo de esto se puede observar en la resistencia de las plantas al patógeno del añublo del arroz , donde el RGA5 NLR tiene un dominio asociado a metales pesados (HMA) integrado en su estructura, al que se dirigen múltiples proteínas efectoras . [15]
Un ejemplo de reconocimiento indirecto: AvrPphB es una proteína efectora de tipo III secretada por Pseudomonas syringae . Se trata de una proteasa que escinde una quinasa celular llamada PBS1. La quinasa modificada es detectada por RPS5 NLR. [dieciséis]
Estudios estructurales recientes de las proteínas CC-NLR han sugerido que una vez que se detectan los factores de virulencia , las NLR se ensamblan en una estructura pentamérica conocida como resistosoma. El resistosoma parece tener una alta afinidad por la membrana celular . Cuando se ensambla el resistosoma, una hélice sobresale del extremo N de cada NLR y esto crea un poro en la membrana que permite que se produzca una fuga de iones y, por lo tanto, la célula muere . Sin embargo, este mecanismo sólo se infiere de la estructura y actualmente no existen estudios mecanicistas que lo respalden. Aún no se sabe cómo se activan las proteínas TIR-NLR . Investigaciones recientes sugieren que requieren proteínas CC-NLR aguas abajo, que luego se activan para formar resistosomas e inducir HR. [17]
Se sabe que las NLR pueden funcionar individualmente, pero también hay casos en los que las proteínas NLR funcionan en pares. El par consta de un sensor NLR y un NLR auxiliar. El sensor NLR es responsable de reconocer la proteína efectora secretada por el patógeno y de activar el NLR auxiliar que luego ejecuta la muerte celular . Los genes tanto del sensor como del respectivo NLR auxiliar suelen estar emparejados en el genoma y su expresión podría ser controlada por el mismo promotor . Esto permite que el par funcional, en lugar de los componentes individuales, se segregue durante la división celular y también garantiza que se produzcan cantidades iguales de ambos NLR en la célula. [18]
Los pares de receptores funcionan a través de dos mecanismos principales: regulación negativa o cooperación.
En el escenario de regulación negativa, el sensor NLR es responsable de regular negativamente el NLR auxiliar y prevenir la muerte celular en condiciones normales. Sin embargo, cuando la proteína efectora es introducida y reconocida por el sensor NLR, se alivia la regulación negativa del NLR auxiliar y se induce la FC. [19]
En los mecanismos de cooperación, cuando el sensor NLR reconoce la proteína efectora , envía una señal al NLR auxiliar, activándola así. [20]
Recientemente, se descubrió que además de actuar como singletons o pares, los NLR de plantas pueden actuar en redes. En estas redes, normalmente hay muchos NLR de sensores emparejados con relativamente pocos NLR auxiliares. [20]
Un ejemplo de proteínas implicadas en las redes NLR son las que pertenecen al superclado NRC. Parece que las redes evolucionaron a partir de un evento de duplicación de un par NLR genéticamente vinculado hacia un locus no vinculado que permitió que el nuevo par evolucionara para responder a un nuevo patógeno . Esta separación parece proporcionar plasticidad al sistema, ya que permite que los NLR del sensor evolucionen más rápidamente en respuesta a la rápida evolución de los efectores de patógenos , mientras que el NLR auxiliar puede evolucionar mucho más lentamente para mantener su capacidad de inducir la FC. Sin embargo, parece que durante la evolución también evolucionaron nuevos NLR auxiliares, supuestamente, porque ciertos NLR de sensores requieren NLR auxiliares específicos para funcionar de manera óptima. [20]
El análisis bioinformático de los NLR de plantas ha demostrado que existe un motivo MADA conservado en el extremo N de los NLR auxiliares, pero no en los NLR sensores. Alrededor del 20% de todos los CC-NLR tienen el motivo MADA, lo que implica la importancia del motivo para la ejecución de recursos humanos. [21]
La activación accidental de HR a través de las proteínas NLR podría causar una gran destrucción del tejido vegetal, por lo que las NLR se mantienen en forma inactiva a través de una estricta regulación negativa tanto a nivel transcripcional como postraduccional . En condiciones normales, el ARNm de las NLR se transcribe en niveles muy bajos, lo que da como resultado niveles bajos de proteína en la célula. Los NLR también requieren una cantidad considerable de proteínas chaperonas para su plegamiento. Las proteínas mal plegadas son inmediatamente ubiquitinadas y degradadas por el proteosoma . [22] Se ha observado que en muchos casos, si se eliminan las proteínas chaperonas implicadas en la biosíntesis de NLR , se suprime la FC y los niveles de NLR se reducen significativamente. [23]
Las interacciones intramoleculares también son esenciales para la regulación de la FC. Las proteínas NLR no son lineales: el dominio NB-ARC está intercalado entre los dominios LRR y TIR / CC . En condiciones normales, hay mucho más ATP presente en el citoplasma que ADP , y esta disposición de las proteínas NLR impide el intercambio espontáneo de ADP por ATP y, por tanto, la activación de la HR. Sólo cuando se detecta un factor de virulencia , el ADP se cambia por ATP . [14]
Las mutaciones en ciertos componentes de la maquinaria de defensa de las plantas dan como resultado que la HR se active sin la presencia de proteínas efectoras de patógenos . Algunas de estas mutaciones se observan en los genes NLR y hacen que estas proteínas NLR se vuelvan autoactivas debido a la alteración de los mecanismos reguladores intramoleculares. Otras mutaciones que causan HR espontánea están presentes en proteínas involucradas en la producción de ROS durante la invasión de patógenos . [3]
La HR también es un proceso sensible a la temperatura y se ha observado que en muchos casos las interacciones planta-patógeno no inducen la HR a temperaturas superiores a 30 °C, lo que posteriormente conduce a una mayor susceptibilidad al patógeno . [24] Los mecanismos detrás de la influencia de la temperatura en la resistencia de las plantas a los patógenos no se comprenden en detalle; sin embargo, las investigaciones sugieren que los niveles de proteína NLR podrían ser importantes en esta regulación. [25] También se propone que a temperaturas más altas las proteínas NLR tienen menos probabilidades de formar complejos oligoméricos , inhibiendo así su capacidad para inducir HR. [26]
También se ha demostrado que la FC depende de las condiciones de luz, lo que podría estar relacionado con la actividad de los cloroplastos y principalmente con su capacidad para generar ROS . [27]
Se ha demostrado que varias enzimas participan en la generación de ROS . Por ejemplo, la cobreaminooxidasa , cataliza la desaminación oxidativa de las poliaminas , especialmente la putrescina , y libera los mediadores de ROS , peróxido de hidrógeno y amoníaco . [28] Otras enzimas que se cree que desempeñan un papel en la producción de ROS incluyen la xantina oxidasa , la NADPH oxidasa , la oxalato oxidasa, las peroxidasas y las amina oxidasas que contienen flavina . [9]
En algunos casos, las células que rodean la lesión sintetizan compuestos antimicrobianos , incluidos fenólicos , fitoalexinas y proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) , incluidas β-glucanasas y quitinasas . Estos compuestos pueden actuar perforando las paredes celulares bacterianas ; o retrasando la maduración, alterando el metabolismo o impidiendo la reproducción del patógeno en cuestión.
Los estudios han sugerido que el modo y la secuencia reales del desmantelamiento de los componentes celulares de las plantas dependen de cada interacción individual planta-patógeno, pero todos los HR parecen requerir la participación de cisteína proteasas . La inducción de la muerte celular y la eliminación de patógenos también requiere una síntesis activa de proteínas, un citoesqueleto de actina intacto y la presencia de ácido salicílico . [8]
Los patógenos han desarrollado varias estrategias para suprimir las respuestas de defensa de las plantas. Los procesos del huésped generalmente a los que se dirigen las bacterias incluyen; alteraciones de las vías de muerte celular programada , inhibición de las defensas basadas en la pared celular y alteración de la señalización de las hormonas vegetales y la expresión de genes de defensa . [29]
Se ha demostrado que el inicio local de la HR en respuesta a ciertos patógenos necrotróficos permite que las plantas desarrollen inmunidad sistémica contra el patógeno . [30] Los científicos han estado tratando de explotar la capacidad de la HR para inducir resistencia sistémica en las plantas con el fin de crear plantas transgénicas resistentes a ciertos patógenos . Los promotores inducibles por patógenos se han relacionado con genes NLR autoactivos para inducir una respuesta de HR sólo cuando el patógeno está presente, pero no en ningún otro momento. Sin embargo, este enfoque ha resultado prácticamente inviable ya que la modificación también conduce a una reducción sustancial del rendimiento de las plantas. [3]
Se ha observado en Arabidopsis que a veces, cuando se cruzan dos líneas de plantas diferentes, la descendencia muestra signos de necrosis híbrida . Esto se debe a que las plantas parentales contienen NLR incompatibles, que cuando se expresan juntas en la misma célula, inducen HR espontánea. [31]
Esta observación planteó la hipótesis de que los patógenos vegetales pueden conducir a la especiación de las plantas: si poblaciones de plantas de la misma especie desarrollan NLR incompatibles en respuesta a diferentes efectores de patógenos , esto puede conducir a una necrosis híbrida en la descendencia F1 , lo que reduce sustancialmente la aptitud de las plantas. la descendencia y el flujo de genes a las generaciones siguientes. [32]
Tanto las plantas como los animales tienen proteínas NLR que parecen tener la misma función biológica: inducir la muerte celular . Los extremos N de los NLR de plantas y animales varían, pero parece que ambos tienen dominios LRR en el extremo C. [33]
Una gran diferencia entre los NLR de animales y plantas está en lo que reconocen. Los NLR de animales reconocen principalmente patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), mientras que los NLR de plantas reconocen principalmente proteínas efectoras de patógenos . Esto tiene sentido ya que los NLR están presentes dentro de la célula y las plantas rara vez tienen patógenos intracelulares , a excepción de los virus , y los virus no tienen PAMP porque están evolucionando rápidamente. Los animales, en cambio, tienen patógenos intracelulares . [34]
La gran mayoría de linajes de plantas, salvo determinadas algas , como Chlamydomonas , tienen NLR. Los NLR también están presentes en muchas especies animales , sin embargo, no están presentes, por ejemplo, en Drosophila melanogaster y artrópodos . [33]
Tras el reconocimiento de los PAMP por los NLR en animales, los NLR se oligomerizan para formar una estructura conocida como inflamasoma , que activa la piroptosis . En las plantas, los estudios estructurales han sugerido que los NLR también se oligomerizan para formar una estructura llamada resistosoma, que también conduce a la muerte celular . Parece que tanto en plantas como en animales, la formación del resistosoma o del inflamasoma , respectivamente, conduce a la muerte celular al formar poros en la membrana . De las estructuras proteicas se deduce que en las plantas los propios NLR son responsables de formar poros en la membrana , mientras que en el caso del inflamasoma , la actividad formadora de poros surge de la gasdermina D que es escindida por las caspasas como resultado de la oligomerización de los NLR. [35] [36] Las células vegetales no tienen caspasas . [37]