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Enzima de restricción

Una enzima de restricción , endonucleasa de restricción , REasa , ENasa o restrictasa es una enzima que corta el ADN en fragmentos en o cerca de sitios de reconocimiento específicos dentro de moléculas conocidos como sitios de restricción . [1] [2] [3] Las enzimas de restricción son una clase del grupo más amplio de enzimas endonucleasas . Las enzimas de restricción se clasifican comúnmente en cinco tipos, que difieren en su estructura y si cortan su sustrato de ADN en su sitio de reconocimiento, o si los sitios de reconocimiento y escisión están separados uno del otro. Para cortar el ADN, todas las enzimas de restricción hacen dos incisiones, una a través de cada cadena principal de azúcar-fosfato (es decir, cada hebra) de la doble hélice del ADN .

Estas enzimas se encuentran en bacterias y arqueas y proporcionan un mecanismo de defensa contra virus invasores . [4] [5] Dentro de un procariota , las enzimas de restricción cortan selectivamente el ADN extraño en un proceso llamado digestión de restricción ; mientras tanto, el ADN del huésped está protegido por una enzima de modificación (una metiltransferasa ) que modifica el ADN procariota y bloquea la escisión. Juntos, estos dos procesos forman el sistema de modificación de restricción . [6]

Se conocen más de 3.600 endonucleasas de restricción que representan más de 250 especificidades diferentes. [7] Más de 3.000 de ellas se han estudiado en detalle y más de 800 de ellas están disponibles comercialmente. [8] Estas enzimas se utilizan rutinariamente para la modificación del ADN en los laboratorios y son una herramienta vital en la clonación molecular . [9] [10] [11]

Historia

El término enzima de restricción se originó a partir de los estudios del fago λ , un virus que infecta bacterias, y el fenómeno de restricción y modificación controlada por el huésped de dicho fago o bacteriófago bacteriano . [12] El fenómeno se identificó por primera vez en el trabajo realizado en los laboratorios de Salvador Luria , Jean Weigle y Giuseppe Bertani a principios de la década de 1950. [13] [14] Se encontró que, para un bacteriófago λ que puede crecer bien en una cepa de Escherichia coli , por ejemplo E. coli C, cuando se cultiva en otra cepa, por ejemplo E. coli K, sus rendimientos pueden caer significativamente, hasta en tres a cinco órdenes de magnitud. La célula huésped, en este ejemplo E. coli K, se conoce como el huésped restrictivo y parece tener la capacidad de reducir la actividad biológica del fago λ. Si un fago se establece en una cepa, la capacidad de ese fago para crecer también se restringe en otras cepas. En la década de 1960, en un trabajo realizado en los laboratorios de Werner Arber y Matthew Meselson se demostró que la restricción es causada por una escisión enzimática del ADN del fago, y por lo tanto la enzima involucrada se denominó enzima de restricción. [4] [15] [16] [17]

Las enzimas de restricción estudiadas por Arber y Meselson fueron enzimas de restricción de tipo I, que escinden el ADN aleatoriamente lejos del sitio de reconocimiento. [18] En 1970, Hamilton O. Smith , Thomas Kelly y Kent Wilcox aislaron y caracterizaron la primera enzima de restricción de tipo II, HindII, de la bacteria Haemophilus influenzae . [19] [20] Las enzimas de restricción de este tipo son más útiles para el trabajo de laboratorio ya que escinden el ADN en el sitio de su secuencia de reconocimiento y son las más comúnmente utilizadas como herramienta de biología molecular. [21] Más tarde, Daniel Nathans y Kathleen Danna demostraron que la escisión del ADN del virus simio 40 (SV40) por enzimas de restricción produce fragmentos específicos que se pueden separar usando electroforesis en gel de poliacrilamida , mostrando así que las enzimas de restricción también se pueden usar para mapear el ADN. [22] Por su trabajo en el descubrimiento y caracterización de las enzimas de restricción, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 fue otorgado a Werner Arber , Daniel Nathans y Hamilton O. Smith . [23] El descubrimiento de las enzimas de restricción permite manipular el ADN, lo que conduce al desarrollo de la tecnología del ADN recombinante que tiene muchas aplicaciones, por ejemplo, permite la producción a gran escala de proteínas como la insulina humana utilizada por pacientes diabéticos . [13] [24]

Orígenes

Las enzimas de restricción probablemente evolucionaron a partir de un ancestro común y se generalizaron a través de la transferencia horizontal de genes . [25] [26] Además, hay cada vez más evidencia de que las endonucleasas de restricción evolucionaron como un elemento genético egoísta . [27]

Sitio de reconocimiento

Un sitio de reconocimiento palindrómico se lee igual en la hebra inversa que en la hebra directa cuando ambas se leen en la misma orientación.

Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos [2] y producen un corte de doble cadena en el ADN. Las secuencias de reconocimiento también se pueden clasificar por el número de bases en su sitio de reconocimiento, generalmente entre 4 y 8 bases, y el número de bases en la secuencia determinará la frecuencia con la que el sitio aparecerá por casualidad en cualquier genoma dado, por ejemplo, una secuencia de 4 pares de bases ocurriría teóricamente una vez cada 4^4 o 256 pb, 6 bases, 4^6 o 4.096 pb, y 8 bases serían 4^8 o 65.536 pb. [28] Muchas de ellas son palindrómicas , lo que significa que la secuencia de bases se lee igual hacia atrás y hacia adelante. [29] En teoría, hay dos tipos de secuencias palindrómicas que pueden ser posibles en el ADN. El palíndromo tipo espejo es similar a los que se encuentran en el texto ordinario, en el que una secuencia se lee igual hacia adelante y hacia atrás en una sola hebra de ADN, como en GTAATG. El palíndromo de repetición invertida también es una secuencia que se lee igual hacia adelante y hacia atrás, pero las secuencias hacia adelante y hacia atrás se encuentran en cadenas de ADN complementarias (es decir, de ADN bicatenario), como en GTATAC (GTATAC es complementario a CATATG). [30] Los palíndromos de repetición invertida son más comunes y tienen mayor importancia biológica que los palíndromos tipo espejo.

La digestión con EcoRI produce extremos "pegajosos" ,

Mientras que la escisión con la enzima de restricción SmaI produce extremos "romos" :

Las secuencias de reconocimiento en el ADN difieren para cada enzima de restricción, lo que produce diferencias en la longitud, la secuencia y la orientación de la cadena ( extremo 5' o extremo 3' ) de un "saliente" del extremo pegajoso de una enzima de restricción. [31]

Las diferentes enzimas de restricción que reconocen la misma secuencia se conocen como neoesquizómeros . Estos suelen escindirse en diferentes lugares de la secuencia. Las diferentes enzimas que reconocen y escinden en el mismo lugar se conocen como isoesquizómeros .

Tipos

Las endonucleasas de restricción naturales se clasifican en cinco grupos (tipos I, II, III, IV y V) según su composición y los requisitos de cofactores enzimáticos , la naturaleza de su secuencia diana y la posición de su sitio de escisión del ADN en relación con la secuencia diana. [32] [33] [34] Sin embargo, el análisis de la secuencia de ADN de las enzimas de restricción muestra grandes variaciones, lo que indica que hay más de cuatro tipos. [35] Todos los tipos de enzimas reconocen secuencias cortas de ADN específicas y llevan a cabo la escisión endonucleolítica del ADN para dar fragmentos específicos con fosfatos 5' terminales. Se diferencian en su secuencia de reconocimiento, composición de subunidades, posición de escisión y requisitos de cofactores, [36] [37] como se resume a continuación:

Tipo l

Las enzimas de restricción de tipo I fueron las primeras en ser identificadas y se identificaron por primera vez en dos cepas diferentes (K-12 y B) de E. coli . [38] Estas enzimas cortan en un sitio que difiere, y está a una distancia aleatoria (al menos 1000 pb) de su sitio de reconocimiento. La escisión en estos sitios aleatorios sigue un proceso de translocación de ADN, lo que demuestra que estas enzimas también son motores moleculares. El sitio de reconocimiento es asimétrico y está compuesto de dos porciones específicas, una que contiene 3-4 nucleótidos y otra que contiene 4-5 nucleótidos, separadas por un espaciador no específico de aproximadamente 6-8 nucleótidos. Estas enzimas son multifuncionales y son capaces de realizar actividades de digestión y modificación de restricción, dependiendo del estado de metilación del ADN objetivo. Los cofactores S-adenosil metionina (AdoMet), trifosfato de adenosina hidrolizado ( ATP ) e iones de magnesio (Mg 2+ ) son necesarios para su actividad completa. Las enzimas de restricción de tipo I poseen tres subunidades llamadas HsdR, HsdM y HsdS; HsdR es necesaria para la digestión de restricción; HsdM es necesaria para agregar grupos metilo al ADN del huésped (actividad metiltransferasa) y HsdS es importante para la especificidad del sitio de reconocimiento (unión al ADN) además de la actividad de digestión de restricción (escisión del ADN) y modificación (ADN metiltransferasa). [32] [38]

Tipo II

Las enzimas de restricción de tipo II típicas difieren de las enzimas de restricción de tipo I en varias formas. Forman homodímeros , con sitios de reconocimiento que generalmente no están divididos y son palindrómicos y tienen una longitud de 4 a 8 nucleótidos. Reconocen y escinden el ADN en el mismo sitio, y no utilizan ATP o AdoMet para su actividad; generalmente solo requieren Mg 2+ como cofactor. [29] Estas enzimas escinden el enlace fosfodiéster del ADN de doble hélice. Puede escindirse en el centro de ambas hebras para producir un extremo romo, o en una posición escalonada dejando salientes llamados extremos pegajosos. [40] Estas son las enzimas de restricción más comúnmente disponibles y utilizadas. En la década de 1990 y principios de la década de 2000, se descubrieron nuevas enzimas de esta familia que no seguían todos los criterios clásicos de esta clase de enzimas, y se desarrolló una nueva nomenclatura de subfamilias para dividir esta gran familia en subcategorías basadas en desviaciones de las características típicas de las enzimas de tipo II. [29] Estos subgrupos se definen utilizando un sufijo de letra.

Las enzimas de restricción de tipo IIB (p. ej., BcgI y BplI) son multímeros que contienen más de una subunidad. [29] Escinden el ADN en ambos lados de su reconocimiento para cortar el sitio de reconocimiento. Requieren cofactores AdoMet y Mg 2+ . Las endonucleasas de restricción de tipo IIE (p. ej., NaeI) escinden el ADN después de la interacción con dos copias de su secuencia de reconocimiento. [29] Un sitio de reconocimiento actúa como objetivo de la escisión, mientras que el otro actúa como un efector alostérico que acelera o mejora la eficiencia de la escisión enzimática. De manera similar a las enzimas de tipo IIE, las endonucleasas de restricción de tipo IIF (p. ej., NgoMIV) interactúan con dos copias de su secuencia de reconocimiento pero escinden ambas secuencias al mismo tiempo. [29] Las endonucleasas de restricción de tipo IIG (p. ej., RM.Eco57I) tienen una sola subunidad, como las enzimas de restricción de tipo II clásicas, pero requieren que el cofactor AdoMet esté activo. [29] Las endonucleasas de restricción de tipo IIM, como DpnI , son capaces de reconocer y cortar el ADN metilado. [29] [41] [42] Las endonucleasas de restricción de tipo IIS (por ejemplo, FokI) cortan el ADN a una distancia definida de sus sitios de reconocimiento asimétrico no palindrómico; [29] esta característica se utiliza ampliamente para realizar técnicas de clonación in vitro como la clonación Golden Gate . Estas enzimas pueden funcionar como dímeros . De manera similar, las enzimas de restricción de tipo IIT (por ejemplo, Bpu10I y BslI) se componen de dos subunidades diferentes. Algunas reconocen secuencias palindrómicas mientras que otras tienen sitios de reconocimiento asimétricos. [29]

Tipo III

Las enzimas de restricción de tipo III (por ejemplo, EcoP15) reconocen dos secuencias no palindrómicas separadas que están orientadas inversamente. Cortan el ADN aproximadamente 20–30 pares de bases después del sitio de reconocimiento. [43] Estas enzimas contienen más de una subunidad y requieren cofactores AdoMet y ATP para sus funciones en la metilación del ADN y la digestión de restricción, respectivamente. [44] Son componentes de los mecanismos de restricción-modificación del ADN procariota que protegen al organismo contra la invasión de ADN extraño. Las enzimas de tipo III son proteínas heterooligoméricas, multifuncionales compuestas por dos subunidades, Res ( P08764 ) y Mod ( P08763 ). La subunidad Mod reconoce la secuencia de ADN específica para el sistema y es una metiltransferasa de modificación ; como tal, es funcionalmente equivalente a las subunidades M y S de la endonucleasa de restricción de tipo I. Res es necesaria para la digestión de restricción, aunque no tiene actividad enzimática por sí sola. Las enzimas de tipo III reconocen secuencias de ADN asimétricas cortas de 5-6 pb de longitud y cortan 25-27 pb corriente abajo para dejar protuberancias 5' cortas y monocatenarias. Requieren la presencia de dos sitios de reconocimiento no metilados orientados inversamente para que se produzca la digestión de restricción. Estas enzimas metilan solo una cadena del ADN, en la posición N-6 de los residuos de adenina, por lo que el ADN recién replicado tendrá solo una cadena metilada, lo que es suficiente para proteger contra la digestión de restricción. Las enzimas de tipo III pertenecen a la subfamilia beta de las adenina metiltransferasas N6 , que contienen los nueve motivos que caracterizan a esta familia, incluido el motivo I, el bolsillo de unión de AdoMet (FXGXG), y el motivo IV, la región catalítica (S/D/N (PP) Y/F). [36] [45]

Tipo IV

Las enzimas de tipo IV reconocen ADN modificado, típicamente metilado, y están ejemplificadas por los sistemas McrBC y Mrr de  E. coli . [35]

Tipo V

Las enzimas de restricción de tipo V (por ejemplo, el complejo cas9 -gRNA de los CRISPR [46] ) utilizan ARN guía para dirigirse a secuencias no palindrómicas específicas que se encuentran en los organismos invasores. Pueden cortar ADN de longitud variable, siempre que se proporcione un ARN guía adecuado. La flexibilidad y facilidad de uso de estas enzimas las hacen prometedoras para futuras aplicaciones de ingeniería genética. [46] [47]

Enzimas de restricción artificiales

Las enzimas de restricción artificiales se pueden generar fusionando un dominio de unión al ADN natural o diseñado con un dominio de nucleasa (a menudo el dominio de escisión de la enzima de restricción de tipo IIS FokI ). [48] Estas enzimas de restricción artificiales pueden dirigirse a sitios de ADN grandes (hasta 36 pb) y pueden diseñarse para unirse a las secuencias de ADN deseadas. [49] Las nucleasas de dedo de zinc son las enzimas de restricción artificiales más utilizadas y generalmente se utilizan en aplicaciones de ingeniería genética , [50] [51] [52] [53] pero también se pueden utilizar para aplicaciones de clonación de genes más estándar. [54] Otras enzimas de restricción artificiales se basan en el dominio de unión al ADN de los efectores TAL . [55] [56]

En 2013, se diseñó una nueva tecnología CRISPR-Cas9, basada en un sistema de defensa viral procariota, para editar el genoma, y ​​fue rápidamente adoptada en los laboratorios. [57] Para más detalles, lea CRISPR (Clustered regularmente interspaced short palindromic repeats).

En 2017, un grupo de la Universidad de Illinois informó sobre el uso de una proteína Argonauta extraída de Pyrococcus furiosus (PfAgo) junto con ADN guía para editar ADN in vitro como enzimas de restricción artificiales. [58]

También se han desarrollado ribonucleasas artificiales que actúan como enzimas de restricción para el ARN. Un sistema basado en PNA , llamado PNAzyme, tiene un grupo Cu(II) -2,9-dimetilfenantrolina que imita a las ribonucleasas para una secuencia de ARN específica y corta en una región sin pares de bases (protuberancia de ARN) del ARN objetivo que se forma cuando la enzima se une al ARN. Esta enzima muestra selectividad al cortar solo en un sitio que no tiene un desajuste o que es cinéticamente preferido de entre dos posibles sitios de corte. [59]

Nomenclatura

Desde su descubrimiento en la década de 1970, se han identificado muchas enzimas de restricción; por ejemplo, se han caracterizado más de 3500 enzimas de restricción de tipo II diferentes. [60] Cada enzima recibe el nombre de la bacteria de la que se aisló, utilizando un sistema de nombres basado en el género , la especie y la cepa bacteriana . [61] [62] Por ejemplo, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se derivó como se muestra en el cuadro.

Aplicaciones

Las enzimas de restricción aisladas se utilizan para manipular el ADN para diferentes aplicaciones científicas.

Se utilizan para ayudar a la inserción de genes en vectores plasmídicos durante la clonación de genes y experimentos de producción de proteínas . Para un uso óptimo, los plásmidos que se utilizan comúnmente para la clonación de genes se modifican para incluir una secuencia polienlazadora corta (llamada sitio de clonación múltiple o MCS) rica en secuencias de reconocimiento de restricción . Esto permite flexibilidad al insertar fragmentos de genes en el vector plasmídico; los sitios de restricción contenidos naturalmente dentro de los genes influyen en la elección de la endonucleasa para digerir el ADN, ya que es necesario evitar la restricción del ADN deseado mientras se cortan intencionalmente los extremos del ADN. Para clonar un fragmento de gen en un vector, tanto el ADN plasmídico como el inserto del gen se cortan típicamente con las mismas enzimas de restricción y luego se pegan con la ayuda de una enzima conocida como ADN ligasa . [63] [64]

Las enzimas de restricción también se pueden utilizar para distinguir alelos de genes al reconocer específicamente cambios de una sola base en el ADN conocidos como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [65] [66] Sin embargo, esto solo es posible si un SNP altera el sitio de restricción presente en el alelo. En este método, la enzima de restricción se puede utilizar para genotipar una muestra de ADN sin la necesidad de una costosa secuenciación de genes . La muestra primero se digiere con la enzima de restricción para generar fragmentos de ADN, y luego los fragmentos de diferentes tamaños se separan por electroforesis en gel . En general, los alelos con sitios de restricción correctos generarán dos bandas visibles de ADN en el gel, y aquellos con sitios de restricción alterados no se cortarán y generarán solo una única banda. También se puede generar un mapa de ADN por digestión de restricción que puede dar las posiciones relativas de los genes. [67] Las diferentes longitudes de ADN generadas por digestión de restricción también producen un patrón específico de bandas después de la electroforesis en gel, y se pueden utilizar para la huella dactilar del ADN .

De manera similar, se utilizan enzimas de restricción para digerir el ADN genómico para el análisis genético mediante Southern blot . Esta técnica permite a los investigadores identificar cuántas copias (o parálogos ) de un gen están presentes en el genoma de un individuo, o cuántas mutaciones genéticas ( polimorfismos ) han ocurrido dentro de una población. El último ejemplo se llama polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). [68]

Las enzimas de restricción artificiales creadas mediante la unión del dominio de escisión del ADN FokI con una matriz de proteínas de unión al ADN o matrices de dedos de zinc, denominadas nucleasas de dedos de zinc (ZFN), son una herramienta poderosa para la edición del genoma del huésped debido a su especificidad de secuencia mejorada. Las ZFN funcionan en pares, y su dimerización se media in situ a través del dominio FokI. Cada matriz de dedos de zinc (ZFA) es capaz de reconocer de 9 a 12 pares de bases, lo que da como resultado 18 a 24 para el par. Un espaciador de 5 a 7 pb entre los sitios de escisión mejora aún más la especificidad de las ZFN, lo que las convierte en una herramienta segura y más precisa que se puede aplicar en humanos. Recientemente se ha llevado a cabo un ensayo clínico de fase I de ZFN para la abolición dirigida del correceptor CCR5 para el VIH-1. [69]

Otros han propuesto utilizar el sistema RM de las bacterias como modelo para diseñar vacunas y terapias antivirales humanas, ya que el sistema RM cumple una función de defensa innata en las bacterias al restringir el tropismo de los bacteriófagos. [70] Hay investigaciones sobre las REases y ZFN que pueden escindir el ADN de varios virus humanos, incluidos HSV-2 , HPV de alto riesgo y VIH-1 , con el objetivo final de inducir mutagénesis dirigida y aberraciones de virus que infectan a humanos. [71] [72] [73] El genoma humano ya contiene restos de genomas retrovirales que han sido inactivados y aprovechados para beneficio propio. De hecho, los mecanismos para silenciar los retroelementos genómicos L1 activos por la exonucleasa de reparación de tres elementos principales 1 (TREX1) y la reparación por escisión complementaria 1 (ERCC) parecen imitar la acción de los sistemas RM en bacterias y la unión de extremos no homólogos (NHEJ) que sigue al uso de ZFN sin una plantilla de reparación. [74] [75]

Ejemplos

Los ejemplos de enzimas de restricción incluyen: [76]

Clave:
* = extremos romos
N = C o G o T o A
W = A o T

Véase también

Referencias

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