La electrofisiología (del griego ἥλεκτ , ēlektron , "ámbar" [ver la etimología de "electrón" ]; φύσις , physis , "naturaleza, origen"; y -λογία , -logia ) es la rama de la fisiología que estudia las propiedades eléctricas de los componentes biológicos. células y tejidos. Implica mediciones de cambios de voltaje o corriente eléctrica o manipulaciones en una amplia variedad de escalas, desde proteínas de un solo canal iónico hasta órganos completos como el corazón . En neurociencia , incluye mediciones de la actividad eléctrica de las neuronas y, en particular, de la actividad del potencial de acción . Los registros de señales eléctricas a gran escala del sistema nervioso , como la electroencefalografía , también pueden denominarse registros electrofisiológicos. [1] Son útiles para electrodiagnóstico y monitorización .
La electrofisiología es la rama de la fisiología que se refiere en términos generales al flujo de iones ( corriente iónica ) en los tejidos biológicos y, en particular, a las técnicas de registro eléctrico que permiten medir este flujo. Las técnicas clásicas de electrofisiología implican colocar electrodos en diversas preparaciones de tejido biológico. Los principales tipos de electrodos son:
Los principales preparativos incluyen:
La electrofisiología neuronal es el estudio de las propiedades eléctricas de las células y tejidos biológicos del sistema nervioso. Con la electrofisiología neuronal, los médicos y especialistas pueden determinar cómo ocurren los trastornos neuronales observando la actividad cerebral del individuo. Actividad como qué partes del cerebro se iluminan durante cualquier situación encontrada. Si un electrodo tiene un diámetro lo suficientemente pequeño (micrómetros), entonces el electrofisiólogo puede optar por insertar la punta en una sola celda. Esta configuración permite la observación directa y el registro intracelular de la actividad eléctrica intracelular de una sola célula. Sin embargo, esta configuración invasiva reduce la vida de la célula y provoca una fuga de sustancias a través de la membrana celular. La actividad intracelular también se puede observar utilizando una pipeta de vidrio (hueca) especialmente formada que contiene un electrolito. En esta técnica, la punta de la pipeta microscópica se presiona contra la membrana celular, a la que se adhiere firmemente mediante una interacción entre el vidrio y los lípidos de la membrana celular. El electrolito dentro de la pipeta puede lograr continuidad fluida con el citoplasma aplicando un pulso de presión negativa a la pipeta para romper la pequeña porción de membrana rodeada por el borde de la pipeta ( grabación de células completas ). Alternativamente, la continuidad iónica puede establecerse "perforando" el parche permitiendo que el agente formador de poros exógeno dentro del electrolito se inserte en el parche de membrana ( registro del parche perforado ). Finalmente, el parche podrá dejarse intacto ( grabación del parche ).
El electrofisiólogo puede optar por no insertar la punta en una sola celda. En cambio, la punta del electrodo puede dejarse en continuidad con el espacio extracelular. Si la punta es lo suficientemente pequeña, dicha configuración puede permitir la observación indirecta y el registro de potenciales de acción de una sola celda, lo que se denomina registro de unidad única . Dependiendo de la preparación y la ubicación precisa, una configuración extracelular puede captar la actividad de varias células cercanas simultáneamente, lo que se denomina grabación de unidades múltiples .
A medida que aumenta el tamaño del electrodo, el poder de resolución disminuye. Los electrodos más grandes son sensibles sólo a la actividad neta de muchas células, denominada potencial de campo local . Los electrodos aún más grandes, como las agujas sin aislamiento y los electrodos de superficie utilizados por los neurofisiólogos clínicos y quirúrgicos, son sensibles sólo a ciertos tipos de actividad sincrónica dentro de poblaciones de células que se cuentan por millones.
Otras técnicas electrofisiológicas clásicas incluyen el registro monocanal y la amperometría .
El registro electrofisiológico en general a veces se denomina electrografía (de electro- + -grafía , "registro eléctrico"), siendo el registro así producido un electrograma. Sin embargo, la palabra electrografía tiene otros sentidos (incluida electrofotografía ), y los tipos específicos de registro electrofisiológico generalmente reciben nombres específicos, construidos según el patrón de electro- + [ forma de combinación de partes del cuerpo ] + -grafía (abreviatura ExG). De manera relacionada, la palabra electrograma (que no es necesaria para esos otros sentidos ) a menudo conlleva el significado específico de electrograma intracardíaco, que es como un electrocardiograma pero con algunos cables invasivos (dentro del corazón) en lugar de solo cables no invasivos (en la piel). Dentro de la categoría de pruebas de electrodiagnóstico se incluye el registro electrofisiológico con fines de diagnóstico clínico . Los distintos modos "ExG" son los siguientes:
Las técnicas electrofisiológicas ópticas fueron creadas por científicos e ingenieros para superar una de las principales limitaciones de las técnicas clásicas. Las técnicas clásicas permiten la observación de la actividad eléctrica en aproximadamente un único punto dentro de un volumen de tejido. Las técnicas clásicas singularizan un fenómeno distribuido. El interés en la distribución espacial de la actividad bioeléctrica impulsó el desarrollo de moléculas capaces de emitir luz en respuesta a su entorno eléctrico o químico. Algunos ejemplos son los tintes sensibles al voltaje y las proteínas fluorescentes. Después de introducir uno o más de dichos compuestos en el tejido mediante perfusión, inyección o expresión génica, se puede observar y registrar la distribución uni o bidimensional de la actividad eléctrica.
El registro intracelular implica medir el voltaje y/o la corriente a través de la membrana de una célula. Para realizar un registro intracelular, se debe insertar la punta de un microelectrodo fino (afilado) dentro de la célula, de modo que se pueda medir el potencial de membrana . Normalmente, el potencial de membrana en reposo de una célula sana será de -60 a -80 mV, y durante un potencial de acción el potencial de membrana podría alcanzar +40 mV. En 1963, Alan Lloyd Hodgkin y Andrew Fielding Huxley ganaron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por su contribución a la comprensión de los mecanismos subyacentes a la generación de potenciales de acción en las neuronas. Sus experimentos incluyeron grabaciones intracelulares del axón gigante del calamar del Atlántico ( Loligo pealei ) y estuvieron entre las primeras aplicaciones de la técnica de la "pinza de voltaje". [3] Hoy en día, la mayoría de los microelectrodos utilizados para el registro intracelular son micropipetas de vidrio, con un diámetro de punta de < 1 micrómetro y una resistencia de varios megaohmios. Las micropipetas se llenan con una solución que tiene una composición iónica similar a la del líquido intracelular de la célula. Un cable de plata clorado insertado en la pipeta conecta eléctricamente el electrolito al amplificador y al circuito de procesamiento de señales. El voltaje medido por el electrodo se compara con el voltaje de un electrodo de referencia, generalmente un alambre de plata recubierto de cloruro de plata en contacto con el líquido extracelular alrededor de la celda. En general, cuanto más pequeña es la punta del electrodo, mayor es su resistencia eléctrica , por lo que un electrodo es un compromiso entre tamaño (lo suficientemente pequeño como para penetrar una sola célula con un daño mínimo a la célula) y resistencia (lo suficientemente baja como para que se puedan transmitir pequeñas señales neuronales). discernido del ruido térmico en la punta del electrodo). Mantener cortes cerebrales sanos es fundamental para registros electrofisiológicos exitosos. La preparación de estos cortes se logra comúnmente con herramientas como el vibratomo Compresstome, lo que garantiza condiciones óptimas para grabaciones precisas y confiables. [4]
La técnica de fijación de voltaje permite al experimentador "fijar" el potencial de la celda en un valor elegido. Esto hace posible medir cuánta corriente iónica atraviesa la membrana de una célula con un voltaje determinado. Esto es importante porque muchos de los canales iónicos de la membrana de una neurona son canales iónicos dependientes de voltaje , que se abren sólo cuando el voltaje de la membrana está dentro de un cierto rango. Las mediciones de corriente con pinza de voltaje son posibles gracias a la sustracción digital casi simultánea de corrientes capacitivas transitorias que pasan cuando el electrodo de registro y la membrana celular se cargan para alterar el potencial de la celda.
La técnica de pinza actual registra el potencial de membrana inyectando corriente en una celda a través del electrodo de registro. A diferencia del modo de fijación de voltaje, donde el potencial de membrana se mantiene a un nivel determinado por el experimentador, en el modo de "fijación de corriente" el potencial de membrana puede variar libremente y el amplificador registra cualquier voltaje que la celda genere por sí sola o como resultado de la estimulación. Esta técnica se utiliza para estudiar cómo responde una célula cuando ingresa corriente eléctrica; Esto es importante, por ejemplo, para comprender cómo responden las neuronas a los neurotransmisores que actúan abriendo canales iónicos de membrana .
La mayoría de los amplificadores de pinza de corriente proporcionan poca o ninguna amplificación de los cambios de voltaje registrados en la celda. El "amplificador" es en realidad un electrómetro , a veces denominado "amplificador de ganancia unitaria"; su objetivo principal es reducir la carga eléctrica de las pequeñas señales (en el rango de mV) producidas por las células para que puedan registrarse con precisión mediante dispositivos electrónicos de baja impedancia . El amplificador aumenta la corriente detrás de la señal mientras disminuye la resistencia por la que pasa esa corriente. Considere este ejemplo basado en la ley de Ohm: se genera un voltaje de 10 mV al pasar 10 nanoamperios de corriente a través de 1 MΩ de resistencia. El electrómetro cambia esta "señal de alta impedancia" a una "señal de baja impedancia" mediante el uso de un circuito seguidor de voltaje . Un seguidor de voltaje lee el voltaje en la entrada (causado por una pequeña corriente a través de una resistencia grande ). Luego instruye a un circuito paralelo que tiene una gran fuente de corriente detrás (la red eléctrica) y ajusta la resistencia de ese circuito paralelo para dar el mismo voltaje de salida, pero a través de una resistencia más baja.
Esta técnica fue desarrollada por Erwin Neher y Bert Sakmann , quienes recibieron el Premio Nobel en 1991. [5] La grabación intracelular convencional implica empalar una célula con un electrodo fino; La grabación con patch-clamp adopta un enfoque diferente. Un microelectrodo con abrazadera de parche es una micropipeta con un diámetro de punta relativamente grande. El microelectrodo se coloca junto a una célula y se aplica una suave succión a través del microelectrodo para atraer un trozo de la membrana celular (el "parche") hacia la punta del microelectrodo; la punta de vidrio forma un "sello" de alta resistencia con la membrana celular. Esta configuración es el modo "unido a la célula" y se puede utilizar para estudiar la actividad de los canales iónicos que están presentes en el parche de membrana. Si ahora se aplica más succión, el pequeño parche de membrana en la punta del electrodo se puede desplazar, dejando el electrodo sellado al resto de la celda. Este modo de "célula completa" permite una grabación intracelular muy estable. Una desventaja (en comparación con el registro intracelular convencional con electrodos afilados) es que el líquido intracelular de la célula se mezcla con la solución dentro del electrodo de registro, por lo que algunos componentes importantes del líquido intracelular pueden diluirse. Una variante de esta técnica, la técnica del "parche perforado", intenta minimizar estos problemas. En lugar de aplicar succión para desplazar el parche de membrana de la punta del electrodo, también es posible hacer pequeños agujeros en el parche con agentes formadores de poros para que las moléculas grandes, como las proteínas, puedan permanecer dentro de la célula y los iones puedan pasar libremente a través de los agujeros. . Además, el parche de membrana se puede separar del resto de la célula. Este enfoque permite analizar farmacológicamente las propiedades de la membrana del parche. Patch-clamp también se puede combinar con la secuenciación de ARN en una técnica conocida como patch-seq extrayendo el contenido celular después del registro para caracterizar la relación de las propiedades electrofisiológicas con la expresión genética y el tipo de célula.
En situaciones en las que se desea registrar el potencial dentro de la membrana celular con un efecto mínimo sobre la constitución iónica del líquido intracelular, se puede utilizar un electrodo afilado. Estas micropipetas (electrodos) son nuevamente como las de parche extraídas de capilares de vidrio, pero el poro es mucho más pequeño, por lo que hay muy poco intercambio iónico entre el líquido intracelular y el electrolito en la pipeta. La resistencia eléctrica del electrodo de la micropipeta se reduce llenándolo con KCl 2-4 M, en lugar de una concentración de sal que imita las concentraciones iónicas intracelulares utilizadas en la sujeción del parche. [6] A menudo, la punta del electrodo se llena con varios tipos de tintes como el amarillo de Lucifer para rellenar las células registradas, para la posterior confirmación de su morfología bajo un microscopio. Los tintes se inyectan aplicando un voltaje positivo o negativo, CC o pulsado a los electrodos, dependiendo de la polaridad del tinte.
Un electrodo introducido en el cerebro de un animal vivo detectará la actividad eléctrica generada por las neuronas adyacentes a la punta del electrodo. Si el electrodo es un microelectrodo, con un tamaño de punta de aproximadamente 1 micrómetro, el electrodo normalmente detectará la actividad de como máximo una neurona. La grabación de este modo se denomina generalmente grabación de "unidad única". Los potenciales de acción registrados son muy parecidos a los potenciales de acción que se registran intracelularmente, pero las señales son mucho más pequeñas (típicamente alrededor de 1 mV). La mayoría de los registros de la actividad de neuronas individuales en animales anestesiados y conscientes se realizan de esta manera. Los registros de neuronas individuales en animales vivos han proporcionado información importante sobre cómo el cerebro procesa la información. Por ejemplo, David Hubel y Torsten Wiesel registraron la actividad de neuronas individuales en la corteza visual primaria del gato anestesiado y mostraron cómo las neuronas individuales en esta área responden a características muy específicas de un estímulo visual. [7] Hubel y Wiesel recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1981. [8]
Para preparar el cerebro para dicha inserción de electrodos, a menudo se emplean dispositivos de corte delicados como el vibratomo compresstome, el vibratomo leica y el micrótomo. Estos instrumentos ayudan a obtener secciones cerebrales delgadas y precisas necesarias para la colocación de electrodos, lo que permite a los neurocientíficos apuntar a regiones cerebrales específicas para registrarlas. [9]
Si la punta del electrodo es un poco más grande, entonces el electrodo podría registrar la actividad generada por varias neuronas. Este tipo de grabación a menudo se denomina "grabación de unidades múltiples" y se utiliza a menudo en animales conscientes para registrar cambios en la actividad en un área discreta del cerebro durante la actividad normal. Las grabaciones de uno o más electrodos que están muy espaciados se pueden usar para identificar la cantidad de células a su alrededor, así como cuáles de los picos provienen de qué celda. Este proceso se llama clasificación de picos y es adecuado en áreas donde hay tipos identificados de células con características de picos bien definidas. Si la punta del electrodo es aún más grande, en general no se puede distinguir la actividad de las neuronas individuales, pero el electrodo aún podrá registrar un potencial de campo generado por la actividad de muchas células.
Los potenciales de campo extracelular son sumideros o fuentes de corriente locales que se generan por la actividad colectiva de muchas células. Habitualmente, un potencial de campo se genera mediante la activación simultánea de muchas neuronas mediante transmisión sináptica . El diagrama de la derecha muestra los potenciales del campo sináptico del hipocampo. A la derecha, el trazo inferior muestra una onda negativa que corresponde a un sumidero de corriente causado por cargas positivas que ingresan a las células a través de los receptores postsinápticos de glutamato , mientras que el trazo superior muestra una onda positiva que se genera por la corriente que sale de la célula (en el cuerpo) para completar el circuito. Para obtener más información, consulte Potencial de campo local .
La amperometría utiliza un electrodo de carbono para registrar cambios en la composición química de los componentes oxidados de una solución biológica. La oxidación y reducción se logra cambiando el voltaje en la superficie activa del electrodo de registro en un proceso conocido como "escaneo". Debido a que ciertas sustancias químicas del cerebro pierden o ganan electrones a voltajes característicos, se pueden identificar especies individuales. La amperometría se ha utilizado para estudiar la exocitosis en los sistemas nervioso y endocrino. Muchos neurotransmisores monoaminas ; por ejemplo, la noradrenalina (noradrenalina), la dopamina y la serotonina (5-HT) son oxidables. El método también se puede utilizar con células que no secretan neurotransmisores oxidables "cargándolas" con 5-HT o dopamina.
La pinza de parche planar es un método novedoso desarrollado para electrofisiología de alto rendimiento. [10] En lugar de colocar una pipeta sobre una célula adherente, la suspensión celular se pipetea sobre un chip que contiene una abertura microestructurada. Luego se coloca una sola celda en el orificio mediante succión y se forma una conexión hermética (Gigaseal). La geometría plana ofrece una variedad de ventajas en comparación con el experimento clásico:
Con este enfoque electrofisiológico, los proteoliposomas , vesículas de membrana o fragmentos de membrana que contienen el canal o transportador de interés se adsorben en una monocapa lipídica pintada sobre un electrodo funcionalizado. Este electrodo consta de un soporte de vidrio, una capa de cromo , una capa de oro y una monocapa de octadecilmercaptano . Debido a que la membrana pintada está sostenida por el electrodo, se la denomina membrana con soporte sólido. Las perturbaciones mecánicas, que normalmente destruyen una membrana lipídica biológica, no influyen en la vida útil de un SSM. El electrodo capacitivo (compuesto por el SSM y las vesículas absorbidas) es tan mecánicamente estable que las soluciones pueden intercambiarse rápidamente en su superficie. Esta propiedad permite la aplicación de saltos rápidos de concentración de sustrato/ligando para investigar la actividad electrogénica de la proteína de interés, medida mediante acoplamiento capacitivo entre las vesículas y el electrodo. [11]
El ensayo de reconocimiento bioeléctrico (BERA) es un método novedoso para la determinación de diversas moléculas químicas y biológicas midiendo los cambios en el potencial de membrana de las células inmovilizadas en una matriz de gel. Además de aumentar la estabilidad de la interfaz electrodo-célula, la inmovilización preserva la viabilidad y las funciones fisiológicas de las células. BERA se utiliza principalmente en aplicaciones de biosensores para analizar analitos que pueden interactuar con las células inmovilizadas cambiando el potencial de la membrana celular. De esta manera, cuando se añade una muestra positiva al sensor, se produce un cambio característico, "similar a una firma", en el potencial eléctrico. BERA es la tecnología central detrás del proyecto paneuropeo FOODSCAN lanzado recientemente, sobre evaluación de riesgos alimentarios y de pesticidas en Europa. [12] BERA se ha utilizado para la detección de virus humanos ( virus de la hepatitis B y C y virus del herpes ), [13] agentes de enfermedades veterinarias ( virus de la fiebre aftosa , priones y virus de la lengua azul ) y virus de plantas (virus del tabaco). y virus del pepino) [14] de una manera específica, rápida (1-2 minutos), reproducible y rentable. El método también se ha utilizado para la detección de toxinas ambientales, como pesticidas [15] [16] [17] y micotoxinas [18] en alimentos, y 2,4,6-tricloroanisol en corcho y vino, [19] [ 20] así como la determinación de concentraciones muy bajas del anión superóxido en muestras clínicas. [21] [22]
Un sensor BERA tiene dos partes:
Un avance reciente es el desarrollo de una técnica llamada identificación molecular mediante ingeniería de membranas (MIME). Esta técnica permite construir células con especificidad definida para prácticamente cualquier molécula de interés, mediante la incorporación de miles de receptores artificiales en la membrana celular. [24]
Si bien no constituye estrictamente una medición experimental, se han desarrollado métodos para examinar las propiedades conductoras de proteínas y biomembranas in silico . Se trata principalmente de simulaciones de dinámica molecular en las que un sistema modelo, como una bicapa lipídica, se somete a un voltaje aplicado externamente. Los estudios que utilizan estas configuraciones han podido estudiar fenómenos dinámicos como la electroporación de membranas [25] y la translocación de iones por canales. [26]
El beneficio de tales métodos es el alto nivel de detalle del mecanismo de conducción activa, dado por la resolución inherentemente alta y la densidad de datos que ofrece la simulación atomística. Existen inconvenientes importantes, dados por la incertidumbre sobre la legitimidad del modelo y el costo computacional de modelar sistemas que son lo suficientemente grandes y en escalas de tiempo suficientes como para considerar que reproducen las propiedades macroscópicas de los sistemas mismos. Si bien las simulaciones atomísticas pueden acceder a escalas de tiempo cercanas o dentro del dominio de los microsegundos, esto sigue siendo varios órdenes de magnitud inferior incluso a la resolución de métodos experimentales como el patch-clamping. [ cita necesaria ]
La electrofisiología clínica es el estudio de cómo se pueden aplicar los principios y tecnologías electrofisiológicos a la salud humana. Por ejemplo, la electrofisiología cardíaca clínica es el estudio de las propiedades eléctricas que gobiernan el ritmo y la actividad del corazón. La electrofisiología cardíaca se puede utilizar para observar y tratar trastornos como la arritmia (latidos cardíacos irregulares). Por ejemplo, un médico puede insertar un catéter que contiene un electrodo en el corazón para registrar la actividad eléctrica del músculo cardíaco.
Otro ejemplo de electrofisiología clínica es la neurofisiología clínica . En esta especialidad médica, los médicos miden las propiedades eléctricas del cerebro , la médula espinal y los nervios . Se considera que científicos como Duchenne de Boulogne (1806–1875) y Nathaniel A. Buchwald (1924–2006) han hecho grandes avances en el campo de la neurofisiología , permitiendo sus aplicaciones clínicas.
Los estándares de información mínima (MI) o las pautas de presentación de informes especifican la cantidad mínima de metadatos (información) y datos necesarios para cumplir uno o varios objetivos específicos en un estudio clínico. La familia de documentos de pautas de presentación de informes "Información mínima sobre una investigación de neurociencia" (MINI) tiene como objetivo proporcionar un conjunto coherente de pautas para informar un experimento de electrofisiología. En la práctica, un módulo MINI comprende una lista de verificación de información que debe proporcionarse (por ejemplo, sobre los protocolos empleados) cuando se describe un conjunto de datos para su publicación. [27]