Los tintes sensibles al voltaje , también conocidos como tintes potenciométricos , son tintes que cambian sus propiedades espectrales en respuesta a cambios de voltaje . [1] Son capaces de proporcionar mediciones lineales de la actividad de activación de neuronas individuales , grandes poblaciones neuronales o la actividad de miocitos . Muchos procesos fisiológicos van acompañados de cambios en el potencial de la membrana celular que pueden detectarse con colorantes sensibles al voltaje. Las mediciones pueden indicar el sitio de origen del potencial de acción y se pueden obtener mediciones de la velocidad y dirección del potencial de acción. [2]
Los tintes potenciométricos se utilizan para monitorear la actividad eléctrica dentro de los orgánulos celulares donde no es posible insertar un electrodo , como las mitocondrias y las espinas dendríticas . Esta tecnología es especialmente poderosa para el estudio de patrones de actividad en preparaciones multicelulares complejas. También hace posible la medición de variaciones espaciales y temporales en el potencial de membrana a lo largo de la superficie de células individuales.
tipos de tintes
Pioneros de los tintes sensibles al voltaje: A. Grinvald, LB Cohen, K. Kamino, BM Salzberg, WN Ross; Tokio, 2000
Sondas de respuesta rápida: son tintes anfifílicos para tinción de membranas que generalmente tienen un par de cadenas de hidrocarburos que actúan como anclajes de la membrana y un grupo hidrófilo que alinea el cromóforo perpendicular a la interfaz membrana/acuosa. Se cree que el cromóforo sufre un gran cambio de carga electrónica como resultado de la excitación desde el suelo al estado excitado y esto subyace al supuesto mecanismo electrocrómico de la sensibilidad de estos tintes al potencial de membrana. Esta molécula (tinte) se intercala entre la parte lipófila de las membranas biológicas . Esta orientación asegura que la redistribución de carga inducida por la excitación se producirá paralela al campo eléctrico dentro de la membrana. Por lo tanto, un cambio en el voltaje a través de la membrana provocará un cambio espectral resultante de una interacción directa entre el campo y el suelo y los momentos dipolares del estado excitado .
Los nuevos tintes de voltaje pueden detectar el voltaje con alta velocidad y sensibilidad mediante transferencia de electrones fotoinducida (PeT) a través de un cable molecular conjugado. [3] [4]
Sondas de respuesta lenta: presentan cambios dependientes del potencial en su distribución transmembrana que van acompañados de un cambio de fluorescencia. Las sondas típicas de respuesta lenta incluyen carbocianinas y rodaminas catiónicas y oxonoles iónicos.
Ejemplos
Los colorantes sensibles al voltaje de uso común son los colorantes de aminonaftiletenilpiridinio (ANEP) sustituidos, como di-4-ANEPPS, di-8-ANEPPS y RH237. Dependiendo de sus modificaciones químicas que cambian sus propiedades físicas se utilizan para diferentes procedimientos experimentales. [5] Fueron descritos por primera vez en 1985 por el grupo de investigación de Leslie Loew. [6] ANNINE-6plus es un tinte sensible al voltaje con respuesta rápida ( tiempo de respuesta ns ) y alta sensibilidad. Guixue Bu et al. lo han aplicado para medir los potenciales de acción de un único túbulo T de cardiomiocitos. [7] Más recientemente, se introdujo una serie de tintes ANEP fluorados que ofrecen mayor sensibilidad y fotoestabilidad; también están disponibles en una amplia variedad de longitudes de onda de excitación y emisión. [8] Un estudio computacional reciente confirmó que los colorantes ANEP se ven afectados únicamente por el entorno electrostático y no por interacciones moleculares específicas. [9] Otros andamios estructurales, como los xantenos, [10] también se utilizan con éxito.
Materiales
El material central para obtener imágenes de la actividad cerebral con tintes sensibles al voltaje son los propios tintes. Estos colorantes sensibles al voltaje son lipófilos y preferentemente están localizados en membranas con sus colas hidrófobas. Se utilizan en aplicaciones que implican fluorescencia o absorción; Son de acción rápida y pueden proporcionar mediciones lineales de cambios en el potencial de membrana. [11] Muchas empresas suministran tintes sensibles al voltaje que ofrecen sondas fluorescentes para aplicaciones biológicas. Potentiometric Probes, LLC se especializa únicamente en tintes sensibles al voltaje; Tienen una licencia exclusiva para distribuir el gran conjunto de VSD fluorados, comercializados bajo la marca ElectroFluor.
Se puede utilizar una variedad de equipos especializados junto con los tintes, y las opciones de equipo variarán según las particularidades de una preparación. Esencialmente, el equipo incluirá microscopios especializados y dispositivos de imágenes, y puede incluir lámparas técnicas o láseres. [11]
Fortalezas y debilidades
Los puntos fuertes de la obtención de imágenes de la actividad cerebral con tintes sensibles al voltaje incluyen las siguientes capacidades:
Se pueden medir simultáneamente señales de población de muchas áreas y se pueden registrar cientos de neuronas. Estas grabaciones multisitio pueden proporcionar información precisa sobre el inicio y la propagación del potencial de acción (incluidas la dirección y la velocidad) y sobre toda la estructura ramificada de una neurona. [11]
Se pueden tomar mediciones de la actividad de picos en un ganglio que está produciendo un comportamiento y pueden proporcionar información sobre cómo se está produciendo el comportamiento. [11]
En determinadas preparaciones, los efectos farmacológicos de los colorantes se pueden revertir por completo retirando la pipeta de tinción y dejando que la neurona se recupere entre 1 y 2 horas. [11]
Se pueden utilizar colorantes para analizar la integración de señales en ramas dendríticas terminales. Los colorantes sensibles al voltaje ofrecen la única alternativa a las proteínas sensibles al voltaje codificadas genéticamente (como las proteínas derivadas de Ci-VSP) para hacer esto. [11]
Los colorantes más solubles, como ElectroFluor-530 o di-2-ANEPEQ, se pueden perfundir internamente en una sola célula a través de una pipeta de parche. Esta técnica ha permitido el estudio de señales eléctricas en dendritas individuales [12] [13] y espinas dendríticas [14] [15] [16] [17] dentro de cortes de cerebro.
Las debilidades de obtener imágenes de la actividad cerebral con tintes sensibles al voltaje incluyen los siguientes problemas:
Los tintes sensibles al voltaje pueden responder de manera muy diferente de una preparación a otra; normalmente se deben probar decenas de tintes para obtener una señal óptima. [11] También se deben optimizar los parámetros de imagen, como la longitud de onda de excitación, la longitud de onda de emisión y el tiempo de exposición.
Los tintes sensibles al voltaje a menudo no logran penetrar a través del tejido conectivo ni moverse a través de espacios intracelulares hasta la región de la membrana deseada para el estudio. [11] La tinción es un problema grave en las aplicaciones de estos tintes. Los colorantes solubles en agua, como ANNINE-6plus , ElectroFluor-530s o di-2-ANEPEQ, no sufren este problema.
Por otro lado, si los tintes son demasiado solubles en agua, es posible que la mancha no persista. Esto se puede solucionar utilizando tintes que contengan cadenas alquílicas más largas para aumentar la lipofilicidad.
El ruido es un problema en todas las preparaciones con tintes sensibles al voltaje y en ciertas preparaciones la señal puede oscurecerse significativamente. [11] Las relaciones señal-ruido se pueden mejorar con algoritmos de filtrado espacial o filtrado temporal. Existen muchos de estos algoritmos; Se puede encontrar un algoritmo de procesamiento de señales en un trabajo reciente con el tinte ANNINE-6plus. [7]
Las células pueden verse afectadas permanentemente por los tratamientos. Es posible que se produzcan efectos farmacológicos duraderos y la fotodinámica de los tintes puede ser perjudicial. [11] Se ha demostrado que los colorantes sensibles a los voltajes fluorados recientemente desarrollados mitigan estos efectos. [8] [18]
Se han publicado muchas aplicaciones en electrofisiología cardíaca, incluido el mapeo ex vivo de la actividad eléctrica en corazones completos de varias especies animales, [29] [30] imágenes subcelulares de cardiomiocitos individuales, [31] e incluso el mapeo de ritmos sinusales y arritmias en corazón abierto. cerdo in vivo , [18] donde los artefactos de movimiento podrían eliminarse mediante imágenes con relación de longitud de onda dual de la fluorescencia del tinte sensible al voltaje.
Referencias
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Otras lecturas
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