Agentes que emiten luz después de la excitación por la luz.
Un fluoróforo (o fluorocromo , de manera similar a un cromóforo ) es un compuesto químico fluorescente que puede reemitir luz tras la excitación de la luz. Los fluoróforos suelen contener varios grupos aromáticos combinados , o moléculas planas o cíclicas con varios enlaces π . [1]
Los fluoróforos se utilizan en ocasiones solos, como trazador en fluidos, como tinte para teñir determinadas estructuras, como sustrato de enzimas , o como sonda o indicador (cuando su fluorescencia se ve afectada por aspectos ambientales como la polaridad o los iones). De manera más general, están unidos covalentemente a macromoléculas y sirven como marcadores (o colorantes, etiquetas o indicadores) para reactivos afines o bioactivos ( anticuerpos , péptidos, ácidos nucleicos). Los fluoróforos se utilizan principalmente para teñir tejidos, células o materiales en una variedad de métodos analíticos, como imágenes fluorescentes y espectroscopia .
La fluoresceína , a través de su isotiocianato de fluoresceína derivado isotiocianato reactivo con aminas (FITC), ha sido uno de los fluoróforos más populares. Del marcaje de anticuerpos, las aplicaciones se han extendido a los ácidos nucleicos gracias a la carboxifluoresceína . Otros fluoróforos históricamente comunes son los derivados de rodamina (TRITC), cumarina y cianina . [2] Las nuevas generaciones de fluoróforos, muchos de los cuales son patentados, a menudo funcionan mejor, siendo más fotoestables, más brillantes o menos sensibles al pH que los tintes tradicionales con excitación y emisión comparables. [3] [4]
Fluorescencia
El fluoróforo absorbe energía luminosa de una longitud de onda específica y reemite luz en una longitud de onda más larga. Las longitudes de onda absorbidas , la eficiencia de transferencia de energía y el tiempo antes de la emisión dependen tanto de la estructura del fluoróforo como de su entorno químico, ya que la molécula en su estado excitado interactúa con las moléculas circundantes. Las longitudes de onda de máxima absorción (≈ excitación) y emisión (por ejemplo, Absorción/Emisión = 485 nm/517 nm) son los términos típicos utilizados para referirse a un fluoróforo determinado, pero puede ser importante considerar todo el espectro. El espectro de longitudes de onda de excitación puede ser una banda muy estrecha o más amplia, o puede estar por encima de un nivel de corte. El espectro de emisión suele ser más nítido que el espectro de excitación, tiene una longitud de onda más larga y, en consecuencia, una energía más baja. Las energías de excitación varían desde el ultravioleta hasta el espectro visible , y las energías de emisión pueden continuar desde la luz visible hasta la región del infrarrojo cercano .
Las principales características de los fluoróforos son:
Longitud de onda máxima de excitación y emisión (expresada en nanómetros (nm)): corresponde al pico en los espectros de excitación y emisión (normalmente un pico cada uno).
Coeficiente de absorción molar (en mol −1 cm −1 ): vincula la cantidad de luz absorbida, a una longitud de onda determinada, con la concentración de fluoróforo en solución.
Rendimiento cuántico : eficiencia de la energía transferida de la luz incidente a la fluorescencia emitida (el número de fotones emitidos por fotones absorbidos).
Vida útil (en picosegundos): duración del estado excitado de un fluoróforo antes de volver a su estado fundamental. Se refiere al tiempo que tarda una población de fluoróforos excitados en desintegrarse a 1/ e (≈0,368) de la cantidad original.
Desplazamiento de Stokes : la diferencia entre las longitudes de onda de excitación máxima y de emisión máxima.
Fracción oscura : proporción de moléculas no activas en la emisión de fluorescencia. Para los puntos cuánticos , la microscopía prolongada de una sola molécula mostró que entre el 20 y el 90% de todas las partículas nunca emiten fluorescencia. [5] Por otro lado, las nanopartículas de polímeros conjugados (Pdots) casi no muestran fracción oscura en su fluorescencia. [6] Las proteínas fluorescentes pueden tener una fracción oscura debido al mal plegamiento de las proteínas o a la formación defectuosa de cromóforos. [7]
Estas características impulsan otras propiedades, incluido el fotoblanqueo o la fotorresistencia (pérdida de fluorescencia tras la excitación de luz continua). Se deben considerar otros parámetros, ya que la polaridad de la molécula del fluoróforo, el tamaño y la forma del fluoróforo (es decir, el patrón de fluorescencia de polarización ) y otros factores pueden cambiar el comportamiento de los fluoróforos.
Las partículas fluorescentes como los puntos cuánticos (de 2 a 10 nm de diámetro, de 100 a 100 000 átomos) también se consideran fluoróforos. [9]
El tamaño del fluoróforo podría obstaculizar estéricamente la molécula marcada y afectar la polaridad de la fluorescencia.
Familias
Las moléculas de fluoróforo podrían utilizarse solas o servir como motivo fluorescente de un sistema funcional. Según la complejidad molecular y los métodos sintéticos, las moléculas de fluoróforo podrían clasificarse generalmente en cuatro categorías: proteínas y péptidos, pequeños compuestos orgánicos, oligómeros y polímeros sintéticos y sistemas de múltiples componentes. [10] [11]
Estos fluoróforos emiten fluorescencia debido a electrones deslocalizados que pueden saltar una banda y estabilizar la energía absorbida. Por ejemplo, el benceno , uno de los hidrocarburos aromáticos más simples, se excita a 254 nm y emite a 300 nm. [12] Esto discrimina los fluoróforos de los puntos cuánticos, que son nanopartículas semiconductoras fluorescentes .
Además, pueden estar presentes varios grupos funcionales para alterar sus propiedades, como la solubilidad, o conferir propiedades especiales, como el ácido borónico que se une a azúcares o múltiples grupos carboxilo para unirse a ciertos cationes. Cuando el tinte contiene un grupo donador de electrones y un grupo aceptor de electrones en extremos opuestos del sistema aromático, este tinte probablemente será sensible a la polaridad del medio ambiente ( solvatocrómico ), por lo que se denomina sensible al medio ambiente. A menudo se utilizan tintes en el interior de las células, que son impermeables a las moléculas cargadas; Como resultado de esto, los grupos carboxilo se convierten en un éster, que se elimina mediante esterasas dentro de las células, por ejemplo, fura-2AM y diacetato de fluoresceína.
Las siguientes familias de tintes son grupos de marcas registradas y no necesariamente comparten similitudes estructurales.
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enlaces externos
La base de datos de tintes fluorescentes.
Tabla de fluorocromos
El manual de sondas moleculares: un recurso integral para la tecnología de fluorescencia y sus aplicaciones.