96 pinzas utilizadas para realizar ensayos puntuales con células de levadura, hongos o bacterias.
Los microorganismos individuales colocados en la placa crecerán hasta formar colonias individuales , cada una de las cuales es un clon genéticamente idéntico al organismo ancestro individual (excepto por la baja e inevitable tasa de mutación ). Por lo tanto, la placa se puede utilizar para estimar la concentración de organismos en un cultivo líquido o una dilución adecuada de ese cultivo utilizando un contador de colonias , o para generar cultivos genéticamente puros a partir de un cultivo mixto de organismos genéticamente diferentes.
Existen varios métodos para sembrar células. Una técnica se conoce como " estiramiento ". En esta técnica, una gota del cultivo en el extremo de un asa de alambre estéril y delgado , a veces llamada inoculador, se esparce por la superficie del agar dejando atrás los organismos, un número mayor al principio del estiramiento y un número menor al final. En algún momento durante un "estiramiento" exitoso, el número de organismos depositados será tal que crecerán colonias individuales distintas en esa área que pueden retirarse para un cultivo posterior, utilizando otro asa estéril.
Otra forma de sembrar organismos en placas de agar, además de la siembra por estrías, es el análisis puntual . Este tipo de análisis se utiliza a menudo para comprobar la viabilidad de las células y se realiza con pinzas (a menudo también llamadas pinzas para sembrar). Una tercera técnica es utilizar perlas de vidrio estériles para sembrar células. En esta técnica, las células se cultivan en un cultivo líquido, en el que se pipetea un pequeño volumen en la placa de agar y luego se esparce con las perlas. La siembra por réplica es otra técnica utilizada para sembrar células en placas de agar. Estas cuatro técnicas son las más comunes, pero también son posibles otras. Es fundamental trabajar de forma estéril para evitar la contaminación de las placas de agar. [1] Por lo tanto, la siembra se suele realizar en una cabina de flujo laminar o en la mesa de trabajo junto a un mechero Bunsen . [2]
Historia
En 1881, Fanny Hesse , que trabajaba como técnica para su marido Walther Hesse en el laboratorio de Robert Koch , sugirió el agar como un agente de fraguado eficaz, ya que había sido común en la elaboración de mermeladas durante algún tiempo. [3]
Tipos
Una placa de agar observada en un contador de colonias electrónicoEjemplo de un algoritmo de evaluación de una posible infección bacteriana en casos sin objetivos específicos solicitados (no bacterias, micobacterias, etc.), con las situaciones y los agentes más comunes observados en un entorno hospitalario comunitario de Nueva Inglaterra. Se utilizan diferentes placas de agar para diferentes fuentes de muestras, como se ve en el cuadrante superior izquierdo.
Al igual que otros medios de crecimiento , las formulaciones de agar utilizadas en placas pueden clasificarse como "definidas" o "indefinidas"; un medio definido se sintetiza a partir de sustancias químicas individuales requeridas por el organismo, por lo que se conoce la composición molecular exacta, mientras que un medio indefinido se elabora a partir de productos naturales como el extracto de levadura , donde se desconoce la composición precisa. [4]
Las placas de agar pueden formularse como permisivas, con la intención de permitir el crecimiento de cualquier organismo presente, o restrictivas o selectivas, con la intención de permitir solo el crecimiento de un subconjunto particular de esos organismos. [5] Esto puede tomar la forma de un requisito nutricional, por ejemplo, proporcionando un compuesto particular como la lactosa como la única fuente de carbono y, por lo tanto, seleccionando solo organismos que puedan metabolizar ese compuesto, o incluyendo un antibiótico particular u otra sustancia para seleccionar solo organismos que sean resistentes a esa sustancia. Esto se correlaciona hasta cierto punto con medios definidos e indefinidos; los medios indefinidos, hechos de productos naturales y que contienen una combinación desconocida de muchas moléculas orgánicas, suelen ser más permisivos en términos de satisfacer las necesidades de una variedad más amplia de organismos. En contraste, los medios definidos pueden adaptarse con precisión para seleccionar organismos con propiedades específicas.
Las placas de agar también pueden ser placas indicadoras, en las que los organismos no se seleccionan en función del crecimiento, sino que se distinguen por un cambio de color en algunas colonias, normalmente causado por la acción de una enzima sobre algún compuesto añadido al medio. [6]
Las placas se incuban durante 12 horas hasta varios días, dependiendo de la prueba que se realice.
Los tipos de placas de agar más utilizados incluyen:
Las placas de agar sangre (BAP) contienen sangre de mamíferos (generalmente de oveja o caballo), típicamente en una concentración del 5 al 10%. Las BAP se enriquecen y se utilizan medios diferenciales para aislar organismos exigentes y detectar la actividad hemolítica . La actividad β-hemolítica mostrará lisis y digestión completa del contenido de glóbulos rojos que rodea una colonia. Los ejemplos incluyen Streptococcus haemolyticus . La α-hemólisis solo causará lisis parcial de los glóbulos rojos (la membrana celular se deja intacta) y aparecerá verde o marrón debido a la conversión de hemoglobina en metahemoglobina. Un ejemplo de esto sería Streptococcus viridans . La γ-hemólisis (o no hemolítica) es el término que se refiere a la falta de actividad hemolítica. [7] Las BAP también contienen extracto de carne o extracto de levadura , triptona , cloruro de sodio y agar. [8]
Agar chocolate
El agar chocolate es un tipo de placa de agar sangre en la que las células sanguíneas se han lisado calentándolas a 80 °C. Se utiliza para el cultivo de bacterias respiratorias exigentes, como Haemophilus influenzae . El agar chocolate recibe su nombre por su color y no contiene chocolate en la placa.
El agar CLED ( agar deficiente en cisteína , lactosa y electrolitos) se utiliza para aislar y diferenciar las bacterias del tracto urinario, ya que inhibe la proliferación de especies de Proteus y puede distinguir entre fermentadores de lactosa y no fermentadores.
El medio de Granada se utiliza para aislar y diferenciar Streptococcus del grupo B y Streptococcus agalactiae de muestras clínicas. Crece en medio de Granada en forma de colonias rojas y la mayoría de las bacterias acompañantes se inhiben.
El agar MacConkey es un medio selectivo y diferencial que se utiliza para diferenciar entre bacterias gramnegativas e inhibir el crecimiento de bacterias grampositivas . La adición de sales biliares y violeta cristal al agar inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias grampositivas, lo que hace que el agar MacConkey sea selectivo. Se añade lactosa y rojo neutro para diferenciar los fermentadores de lactosa, que forman colonias rosadas, de los no fermentadores de lactosa, que forman colonias transparentes. Un medio alternativo, el azul de metileno con eosina, cumple una función similar. [11]
El agar sal manitol es también un medio selectivo y diferencial. El manitol indica los organismos que fermentan el manitol: la fermentación del manitol produce ácido láctico , lo que reduce el pH y hace que la placa se torne amarilla. La sal sirve para seleccionar halófilos ; los organismos que no pueden soportar un alto contenido de sal no pueden crecer bien.
El agar Mueller-Hinton contiene infusión de carne de res, peptona y almidón , y se utiliza principalmente para pruebas de sensibilidad a los antibióticos. Puede presentarse en forma de agar sangre.
El agar nutritivo se utiliza habitualmente para el crecimiento de organismos no exigentes y la observación de la producción de pigmentos. Es seguro utilizarlo en los laboratorios de ciencias escolares porque no permite el crecimiento selectivo de bacterias patógenas .
El agar Önöz permite un diagnóstico bacteriológico más rápido, ya que las colonias de Salmonella y Shigella se pueden diferenciar de forma clara y fiable de otras enterobacterias. Los rendimientos de Salmonella a partir de muestras de heces obtenidas, cuando se utiliza este medio, son superiores a los obtenidos con agar LEIFSON o agar Salmonella–Shigella .
El agar alcohol feniletílico selecciona especies de Staphylococcus mientras inhibe los bacilos gramnegativos (por ejemplo, Escherichia coli , Shigella , Proteus , etc.).
El agar R2A , un medio no específico, imita al agua, por lo que se utiliza para el análisis de agua.
El agar de soja tripticasa (TSA) es un medio de uso general producido por digestión enzimática de harina de soja y caseína . Con frecuencia es el medio base de otros tipos de agar; por ejemplo, las placas de agar sangre se elaboran enriqueciendo las placas de TSA con sangre. Las placas de TSA favorecen el crecimiento de muchas bacterias semifastidiosas, incluidas algunas especies de Brucella , Corynebacterium , Listeria , Neisseria y Vibrio .
El agar Sabouraud se utiliza para cultivar hongos y tiene un pH bajo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias; también contiene el antibiótico gentamicina para inhibir específicamente el crecimiento de bacterias Gram-negativas.
El agar infusión de heno es específico para el cultivo de mohos mucilaginosos (que no son hongos).
Los agares cromogénicos pueden distinguir algunos tipos principales de infecciones fúngicas.
Vista inferior de una placa de agar Sabouraud con una colonia de Trichophyton rubrum var. rodhaini
CHROMAgar (un agar cromogénico ) con su presentación distintiva de algunos de los principales patógenos fúngicos.
Hongos ( ascomicetos ) que crecen en cultivos axénicos , cada uno de los cuales es un cultivo de un organismo seleccionado y está libre de todos los demás organismos, lo que permite el estudio del organismo cultivado de forma aislada.
El medio de esporulación es el medio que se utiliza cuando se deben formar esporas. También se puede utilizar cuando se trabaja con hongos o bacterias, dependiendo de si la cepa es capaz o no de formar esporas.
Mega Plato
Una placa de Petri de 2' x 4' llena de 14 litros de medio de agar derivado de algas marinas creado por científicos de Harvard que se utilizó para ver cómo la E. coli evolucionó hasta volverse resistente a los antibióticos. La megaplaca también ayudó a estudiar conceptos más singulares de la microbiología, como la evolución paralela, la selección por mutaciones, la interferencia colonial, etc. [13]
^ ab Madigan M, Martinko J, eds. (2005). Brock Biología de microorganismos (11.ª ed.). Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1.
^ Sanders, Erin R. (11 de mayo de 2012). "Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods". Journal of Visualized Experiments (63): e3064. doi :10.3791/3064. PMC 4846335. PMID 22617405. Archivado desde el original el 14 de noviembre de 2017. Consultado el 3 de mayo de 2018 .
^ "Historia de la placa de agar". Noticias de laboratorio . Archivado desde el original el 11 de febrero de 2010. Consultado el 22 de febrero de 2010 .
^ Ryan KJ; Ray CG, eds. (2004). Microbiología médica de Sherris (4.ª ed.). McGraw Hill. ISBN0-8385-8529-9.
^ "Placas indicadoras" . Consultado el 12 de julio de 2018 .
^ "Placas de agar sangre y protocolos de hemólisis". Archivado desde el original el 2012-02-02 . Consultado el 2014-10-28 .
^ "Agar sangre: composición, preparación, usos e imágenes", Microbiology Info.com
^ ab Fisher, Bruce; Harvey, Richard P.; Champe, Pamela C. (2007). Reseñas ilustradas de Lippincott: microbiología (Serie Reseñas ilustradas de Lippincott) . Hagerstwon, MD: Lippincott Williams & Wilkins. ISBN978-0-7817-8215-9.
^ Miller, JH (1972). Experimentos en genética molecular. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York.
^ Jung, Benjamin; Hoilat, Gilles J. (2022), "MacConkey Medium", StatPearls , Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, PMID 32491326 , consultado el 12 de diciembre de 2022
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