Las técnicas de ingeniería genética permiten la modificación de genomas de animales y plantas . Se han ideado técnicas para insertar, eliminar y modificar ADN en múltiples niveles, desde un par de bases específico en un gen específico hasta genes completos. Hay una serie de pasos que se siguen antes de que se cree un organismo genéticamente modificado (OGM). Los ingenieros genéticos primero deben elegir qué gen desean insertar, modificar o eliminar. A continuación, el gen debe aislarse e incorporarse, junto con otros elementos genéticos, a un vector adecuado . Luego, este vector se utiliza para insertar el gen en el genoma del huésped, creando un organismo transgénico o editado.
La capacidad de diseñar organismos genéticamente se basa en años de investigación y descubrimiento sobre la función y manipulación de los genes. Entre los avances importantes se incluyen el descubrimiento de enzimas de restricción , ADN ligasas y el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa y su secuenciación .
Los genes añadidos suelen ir acompañados de regiones promotoras y terminadoras , así como de un gen marcador seleccionable . El gen agregado puede modificarse para que se exprese de manera más eficiente. Luego, este vector se inserta en el genoma del organismo huésped. En los animales, el gen normalmente se inserta en células madre embrionarias , mientras que en las plantas se puede insertar en cualquier tejido que pueda cultivarse hasta convertirse en una planta completamente desarrollada.
Se llevan a cabo pruebas en el organismo modificado para garantizar una integración, herencia y expresión estables. Los descendientes de la primera generación son heterocigotos , lo que requiere que sean consanguíneos para crear el patrón homocigoto necesario para una herencia estable. La homocigosidad debe confirmarse en muestras de segunda generación.
Las primeras técnicas insertaban aleatoriamente los genes en el genoma. Los avances permiten apuntar a ubicaciones específicas, lo que reduce los efectos secundarios no deseados. Las primeras técnicas se basaban en meganucleasas y nucleasas con dedos de zinc . Desde 2009 se han desarrollado sistemas más precisos y fáciles de implementar. Las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) y el sistema Cas9-guideRNA (adaptado de CRISPR ) son los dos más comunes.
Muchos descubrimientos y avances diferentes llevaron al desarrollo de la ingeniería genética . La manipulación genética dirigida por el hombre comenzó con la domesticación de plantas y animales mediante selección artificial alrededor del año 12.000 a.C. [1] : 1 Se desarrollaron varias técnicas para ayudar en el mejoramiento y la selección. La hibridación era una forma de introducir cambios rápidos en la composición genética de un organismo. La hibridación de cultivos probablemente ocurrió por primera vez cuando los humanos comenzaron a cultivar individuos genéticamente distintos de especies relacionadas en estrecha proximidad. [2] : 32 Algunas plantas pudieron propagarse mediante clonación vegetativa . [2] : 31
La herencia genética fue descubierta por primera vez por Gregor Mendel en 1865, tras experimentos en el cruce de guisantes. [3] En 1928, Frederick Griffith demostró la existencia de un "principio transformador" involucrado en la herencia, que fue identificado como ADN en 1944 por Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty . Frederick Sanger desarrolló un método para secuenciar el ADN en 1977, aumentando considerablemente la información genética disponible para los investigadores.
Tras descubrir la existencia y propiedades del ADN , hubo que desarrollar herramientas que permitieran manipularlo. En 1970, el laboratorio de Hamilton Smith descubrió las enzimas de restricción , que permitieron a los científicos aislar genes del genoma de un organismo. [4] Las ADN ligasas , que unen el ADN roto, se descubrieron a principios de 1967. [5] Combinando las dos enzimas fue posible "cortar y pegar" secuencias de ADN para crear ADN recombinante . Los plásmidos , descubiertos en 1952, [6] se convirtieron en herramientas importantes para transferir información entre células y replicar secuencias de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Kary Mullis en 1983, permitió amplificar (replicar) pequeñas secciones de ADN y ayudó a la identificación y aislamiento de material genético.
Además de manipular el ADN, fue necesario desarrollar técnicas para su inserción en el genoma de un organismo. El experimento de Griffith ya había demostrado que algunas bacterias tenían la capacidad de captar y expresar de forma natural ADN extraño . La competencia artificial fue inducida en Escherichia coli en 1970 tratándolas con una solución de cloruro de calcio (CaCl 2 ). [7] La transformación mediante electroporación se desarrolló a finales de la década de 1980, aumentando la eficiencia y el rango bacteriano. [8] En 1907 se había descubierto una bacteria que causaba tumores en las plantas, Agrobacterium tumefaciens . A principios de los años 1970 se descubrió que esta bacteria insertaba su ADN en plantas utilizando un plásmido Ti . [9] Al eliminar los genes del plásmido que causó el tumor y agregar genes nuevos, los investigadores pudieron infectar plantas con A. tumefaciens y permitir que las bacterias insertaran el ADN elegido en los genomas de las plantas. [10]
El primer paso es identificar el gen o genes diana para insertarlos en el organismo huésped. Esto está impulsado por el objetivo del organismo resultante. En algunos casos sólo uno o dos genes se ven afectados. Para objetivos más complejos pueden estar involucradas vías biosintéticas completas que involucran múltiples genes. Una vez encontrados, los genes y otra información genética de una amplia gama de organismos se pueden insertar en bacterias para su almacenamiento y modificación, creando bacterias genéticamente modificadas en el proceso. Las bacterias son baratas, fáciles de cultivar, clonales , se multiplican rápidamente, relativamente fáciles de transformar y pueden almacenarse a -80 °C casi indefinidamente. Una vez que se aísla un gen, se puede almacenar dentro de la bacteria, proporcionando un suministro ilimitado para la investigación. [11]
Se pueden realizar exámenes genéticos para determinar genes potenciales seguidos de otras pruebas que identifiquen a los mejores candidatos. Una prueba simple implica mutar aleatoriamente el ADN con productos químicos o radiación y luego seleccionar aquellos que muestren el rasgo deseado. Para los organismos donde la mutación no es práctica, los científicos buscan individuos entre la población que presenten la característica a través de mutaciones naturales. Los procesos que analizan un fenotipo y luego intentan identificar el gen responsable se denominan genética directa . Luego es necesario mapear el gen comparando la herencia del fenotipo con marcadores genéticos conocidos . Es probable que los genes que están muy juntos se hereden juntos. [12]
Otra opción es la genética inversa . Este enfoque implica apuntar a un gen específico con una mutación y luego observar qué fenotipo se desarrolla. [12] La mutación puede diseñarse para inactivar el gen o permitir que solo se active bajo ciertas condiciones. Las mutaciones condicionales son útiles para identificar genes que normalmente son letales si no son funcionales. [13] Como los genes con funciones similares comparten secuencias similares ( homólogas ), es posible predecir la función probable de un gen comparando su secuencia con la de genes bien estudiados de organismos modelo . [12] El desarrollo de microarrays , transcriptomas y secuenciación del genoma ha hecho que sea mucho más fácil encontrar genes deseables. [14]
La bacteria Bacillus thuringiensis fue descubierta por primera vez en 1901 como agente causante de la muerte de los gusanos de seda . Debido a estas propiedades insecticidas, la bacteria se utilizó como insecticida biológico , desarrollado comercialmente en 1938. Se descubrió que las proteínas cry proporcionaban actividad insecticida en 1956 y, en la década de 1980, los científicos habían clonado con éxito el gen que codifica esta proteína y lo expresaban. esto en las plantas. [15] El gen que proporciona resistencia al herbicida glifosato se encontró después de siete años de búsqueda en bacterias que viven en la tubería de salida de una instalación de fabricación de Monsanto RoundUp . [16] En los animales, la mayoría de los genes utilizados son genes de la hormona del crecimiento . [17]
Todos los procesos de ingeniería genética implican la modificación del ADN. Tradicionalmente el ADN se aislaba de las células de los organismos. Posteriormente, los genes llegaron a clonarse a partir de un segmento de ADN tras la creación de una biblioteca de ADN o a sintetizarse artificialmente . Una vez aislado, se añaden elementos genéticos adicionales al gen para permitir que se exprese en el organismo huésped y ayudar en la selección.
Primero se debe abrir suavemente la célula , exponiendo el ADN sin causarle demasiado daño. Los métodos utilizados varían según el tipo de célula. Una vez abierto, el ADN debe separarse del resto de componentes celulares. Una célula rota contiene proteínas y otros restos celulares. Mezclando con fenol y/o cloroformo , seguido de centrifugación , los ácidos nucleicos se pueden separar de estos residuos en una fase acuosa superior . Esta fase acuosa se puede eliminar y purificar adicionalmente si es necesario repitiendo las etapas de fenol-cloroformo. A continuación, los ácidos nucleicos pueden precipitarse a partir de la solución acuosa usando etanol o isopropanol . Cualquier ARN se puede eliminar agregando una ribonucleasa que lo degradará. Muchas empresas venden ahora kits que simplifican el proceso. [18]
El gen que los investigadores buscan modificar (conocido como gen de interés) debe separarse del ADN extraído. Si no se conoce la secuencia, un método común es romper el ADN con un método de digestión aleatoria. Esto generalmente se logra usando enzimas de restricción (enzimas que cortan el ADN). Una digestión de restricción parcial corta sólo algunos de los sitios de restricción, lo que da como resultado segmentos de fragmentos de ADN superpuestos. Los fragmentos de ADN se colocan en vectores plásmidos individuales y se cultivan dentro de bacterias. Una vez en la bacteria, el plásmido se copia a medida que la bacteria se divide . Para determinar si un gen útil está presente en un fragmento particular, se analiza la biblioteca de ADN para detectar el fenotipo deseado . Si se detecta el fenotipo, es posible que la bacteria contenga el gen diana.
Si el gen no tiene un fenotipo detectable o una biblioteca de ADN no contiene el gen correcto, se deben utilizar otros métodos para aislarlo. Si la posición del gen se puede determinar utilizando marcadores moleculares , entonces el recorrido cromosómico es una forma de aislar el fragmento de ADN correcto. Si el gen expresa una estrecha homología con un gen conocido en otra especie, entonces podría aislarse buscando genes en la biblioteca que coincidan estrechamente con el gen conocido. [19]
Para secuencias de ADN conocidas, se pueden utilizar enzimas de restricción que cortan el ADN en cualquier lado del gen. Luego, la electroforesis en gel clasifica los fragmentos según su longitud. [20] Algunos geles pueden separar secuencias que difieren en un solo par de bases . El ADN se puede visualizar teñiéndolo con bromuro de etidio y fotografiándolo bajo luz ultravioleta . Se puede colocar un marcador con fragmentos de longitudes conocidas junto al ADN para estimar el tamaño de cada banda. La banda de ADN del tamaño correcto debe contener el gen, donde se puede extraer del gel. [18] : 40–41 Otra técnica para aislar genes de secuencias conocidas implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [21] La PCR es una herramienta poderosa que puede amplificar una secuencia determinada, que luego puede aislarse mediante electroforesis en gel. Su eficacia disminuye con genes más grandes y tiene el potencial de introducir errores en la secuencia.
Es posible sintetizar genes artificialmente . [22] Algunas secuencias sintéticas están disponibles comercialmente, renunciando a muchos de estos primeros pasos. [23]
El gen a insertar debe combinarse con otros elementos genéticos para que funcione correctamente. El gen se puede modificar en esta etapa para una mejor expresión o efectividad. Además del gen que se va a insertar, la mayoría de las construcciones contienen una región promotora y terminadora , así como un gen marcador seleccionable . La región promotora inicia la transcripción del gen y puede usarse para controlar la ubicación y el nivel de expresión génica, mientras que la región terminadora finaliza la transcripción. Se utiliza un marcador seleccionable, que en la mayoría de los casos confiere resistencia a los antibióticos al organismo en el que se expresa, para determinar qué células se transforman con el nuevo gen. Las construcciones se elaboran utilizando técnicas de ADN recombinante , como digestiones de restricción , ligaciones y clonación molecular . [24]
Una vez que se construye el gen, debe integrarse de manera estable en el genoma del organismo objetivo o existir como ADN extracromosómico . Hay varias técnicas disponibles para insertar el gen en el genoma del huésped y varían según el tipo de organismo objetivo. En eucariotas multicelulares , si el transgén se incorpora a las células de la línea germinal del huésped , la célula huésped resultante puede pasar el transgén a su progenie . Si el transgén se incorpora a células somáticas , el transgén no se puede heredar. [25]
La transformación es la alteración directa de los componentes genéticos de una célula al hacer pasar el material genético a través de la membrana celular . Aproximadamente el 1% de las bacterias son naturalmente capaces de absorber ADN extraño , pero esta capacidad puede inducirse en otras bacterias. [26] Estresar a las bacterias con un choque térmico o electroporación puede hacer que la membrana celular sea permeable al ADN que luego puede incorporarse al genoma o existir como ADN extracromosómico. Normalmente, las células se incuban en una solución que contiene cationes divalentes (a menudo cloruro de calcio ) en condiciones de frío, antes de exponerlas a un pulso de calor (choque térmico). El cloruro de calcio altera parcialmente la membrana celular, lo que permite que el ADN recombinante ingrese a la célula huésped. Se sugiere que exponer las células a cationes divalentes en condiciones de frío puede cambiar o debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable al ADN. Se cree que el pulso de calor crea un desequilibrio térmico a través de la membrana celular, lo que obliga al ADN a ingresar a las células a través de los poros celulares o de la pared celular dañada. La electroporación es otro método para promover la competencia. En este método, las células reciben una descarga breve con un campo eléctrico de 10-20 kV /cm, que se cree que crea agujeros en la membrana celular a través de los cuales puede entrar el ADN plasmídico. Después de la descarga eléctrica, los mecanismos de reparación de la membrana celular cierran rápidamente los agujeros. El ADN absorbido puede integrarse con el genoma bacteriano o, más comúnmente, existir como ADN extracromosómico .
En las plantas, el ADN a menudo se inserta mediante recombinación mediada por Agrobacterium , [27] aprovechando la secuencia de ADN T de Agrobacterium que permite la inserción natural de material genético en las células vegetales. [28] El tejido vegetal se corta en trozos pequeños y se sumergen en un líquido que contiene Agrobacterium suspendido . Las bacterias se adherirán a muchas de las células vegetales expuestas por los cortes. La bacteria utiliza la conjugación para transferir un segmento de ADN llamado ADN-T desde su plásmido a la planta. El ADN transferido se dirige al núcleo de la célula vegetal y se integra en el ADN genómico de la planta huésped. El ADN-T plásmido se integra de forma semialeatoria en el genoma de la célula huésped. [29]
Al modificar el plásmido para expresar el gen de interés, los investigadores pueden insertar el gen elegido de manera estable en el genoma de la planta. Las únicas partes esenciales del ADN-T son sus dos pequeñas repeticiones fronterizas (25 pares de bases), de las cuales al menos una es necesaria para la transformación de las plantas. [30] [31] Los genes que se introducirán en la planta se clonan en un vector de transformación de plantas que contiene la región de ADN-T del plásmido . Un método alternativo es la agroinfiltración . [32] [33]
Otro método utilizado para transformar células vegetales es la biolística , en la que partículas de oro o tungsteno se recubren con ADN y luego se inyectan en células vegetales jóvenes o embriones de plantas. [34] Parte del material genético ingresa a las células y las transforma. Este método se puede utilizar en plantas que no son susceptibles a la infección por Agrobacterium y también permite la transformación de los plástidos de las plantas . Las células vegetales también se pueden transformar mediante electroporación, que utiliza una descarga eléctrica para hacer que la membrana celular sea permeable al ADN plasmídico. Debido al daño causado a las células y al ADN, la eficiencia de transformación de la biolística y la electroporación es menor que la transformación agrobacteriana. [ cita necesaria ]
La transformación tiene un significado diferente en relación con los animales, ya que indica progresión a un estado canceroso, por lo que el proceso utilizado para insertar ADN extraño en células animales suele denominarse transfección. [35] Hay muchas maneras de introducir ADN directamente en células animales in vitro . A menudo, estas células son células madre que se utilizan para terapia génica . Los métodos químicos utilizan compuestos naturales o sintéticos para formar partículas que facilitan la transferencia de genes a las células. [36] Estos vectores sintéticos tienen la capacidad de unirse al ADN y acomodar grandes transferencias genéticas. [37] Uno de los métodos más simples implica el uso de fosfato de calcio para unir el ADN y luego exponerlo a células cultivadas. La solución, junto con el ADN, es encapsulada por las células. [38] Los liposomas y polímeros se pueden utilizar como vectores para introducir ADN en células animales cultivadas. Los liposomas cargados positivamente se unen al ADN, mientras que se pueden diseñar polímeros que interactúen con el ADN. [36] Forman lipoplexes y poliplexes respectivamente, que luego son absorbidos por las células. Otras técnicas incluyen el uso de electroporación y biolística. [39] En algunos casos, las células transfectadas pueden integrar de forma estable ADN externo en su propio genoma; este proceso se conoce como transfección estable . [40]
Para crear animales transgénicos, el ADN debe insertarse en embriones u óvulos viables. Esto generalmente se logra mediante microinyección , donde el ADN se inyecta a través de la envoltura nuclear de la célula directamente en el núcleo . [26] Los óvulos fertilizados superovulados se recolectan en la etapa de célula única y se cultivan in vitro . Cuando los pronúcleos de la cabeza del espermatozoide y del óvulo son visibles a través del protoplasma, se inyecta material genético en uno de ellos. Luego, el ovocito se implanta en el oviducto de un animal pseudopreñado . [41] Otro método es la transferencia de genes mediada por células madre embrionarias. El gen se transfecta en células madre embrionarias y luego se inserta en blastocistos de ratón que luego se implantan en madres adoptivas. La descendencia resultante es quimérica y un mayor apareamiento puede producir ratones completamente transgénicos con el gen de interés. [42]
La transducción es el proceso mediante el cual un virus o vector viral introduce ADN extraño en una célula . [43] Los virus modificados genéticamente se pueden utilizar como vectores virales para transferir genes diana a otro organismo en la terapia génica . [44] Primero, se eliminan los genes virulentos del virus y en su lugar se insertan los genes diana. Las secuencias que permiten al virus insertar los genes en el organismo huésped deben dejarse intactas. Los vectores de virus populares se desarrollan a partir de retrovirus o adenovirus . Otros virus utilizados como vectores incluyen lentivirus , poxvirus y herpesvirus . El tipo de virus utilizado dependerá de las células a las que se dirige y de si el ADN se va a alterar de forma permanente o temporal.
Como a menudo sólo se transforma una única célula con material genético, el organismo debe regenerarse a partir de esa única célula. En las plantas esto se logra mediante el uso de cultivo de tejidos . [45] [46] Cada especie de planta tiene diferentes requisitos para una regeneración exitosa. Si tiene éxito, la técnica produce una planta adulta que contiene el transgén en cada célula. [47] En los animales es necesario garantizar que el ADN insertado esté presente en las células madre embrionarias . [27] La descendencia puede ser examinada para detectar el gen. Todos los descendientes de la primera generación son heterocigotos para el gen insertado y deben ser consanguíneos para producir un espécimen homocigoto . [ cita necesaria ] Las bacterias constan de una sola célula y se reproducen clonalmente, por lo que no es necesaria la regeneración. Se utilizan marcadores seleccionables para diferenciar fácilmente las células transformadas de las no transformadas.
Las células que se han transformado exitosamente con el ADN contienen el gen marcador, mientras que las que no se han transformado no lo tendrán. Al hacer crecer las células en presencia de un antibiótico o una sustancia química que selecciona o marca las células que expresan ese gen, es posible separar las células modificadas de las no modificadas. Otro método de detección implica una sonda de ADN que se adhiere únicamente al gen insertado. Estos marcadores suelen estar presentes en el organismo transgénico, aunque se han desarrollado varias estrategias que pueden eliminar el marcador seleccionable de la planta transgénica madura. [48]
Descubrir que un organismo recombinante contiene los genes insertados no suele ser suficiente para garantizar que se expresarán adecuadamente en los tejidos previstos. Se realizan pruebas adicionales mediante PCR, hibridación Southern y secuenciación de ADN para confirmar que un organismo contiene el nuevo gen. [49] Estas pruebas también pueden confirmar la ubicación cromosómica y el número de copias del gen insertado. Una vez confirmados, los métodos que buscan y miden los productos genéticos (ARN y proteínas) también se utilizan para evaluar la expresión genética, la transcripción, los patrones de procesamiento del ARN y la expresión y localización de los productos proteicos. Estos incluyen hibridación Northern , RT-PCR cuantitativa , Western blot , inmunofluorescencia , ELISA y análisis fenotípico. [50] Cuando corresponde, la descendencia del organismo se estudia para confirmar que el transgén y el fenotipo asociado se heredan de manera estable.
Los métodos tradicionales de ingeniería genética generalmente insertan el nuevo material genético de forma aleatoria dentro del genoma del huésped. Esto puede dañar o alterar otros genes dentro del organismo. Se desarrollaron métodos que insertaban el nuevo material genético en sitios específicos dentro del genoma de un organismo. Los primeros métodos que apuntaban a genes en ciertos sitios dentro de un genoma se basaban en la recombinación homóloga (HR). [51] Al crear construcciones de ADN que contienen una plantilla que coincide con la secuencia del genoma objetivo, es posible que los procesos de recursos humanos dentro de la célula inserten la construcción en la ubicación deseada. El uso de este método con células madre embrionarias condujo al desarrollo de ratones transgénicos con objetivos desactivados . También ha sido posible activar genes o alterar patrones de expresión genética . [52]
Si se elimina un gen vital, puede resultar letal para el organismo. Para estudiar la función de estos genes, se utilizaron recombinasas específicas de sitio (SSR). Los dos tipos más comunes son los sistemas Cre-LoxP y Flp-FRT . La recombinasa Cre es una enzima que elimina el ADN mediante recombinación homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P. El sistema Flip-FRT funciona de manera similar: la recombinasa Flip reconoce secuencias FRT. Al cruzar un organismo que contiene los sitios de recombinasa que flanquean el gen de interés con un organismo que expresa el SSR bajo el control de promotores específicos de tejido , es posible desactivar o activar genes sólo en ciertas células. Esto también se ha utilizado para eliminar genes marcadores de animales transgénicos. Modificaciones adicionales de estos sistemas permitieron a los investigadores inducir la recombinación solo bajo ciertas condiciones, permitiendo que los genes fueran eliminados o expresados en momentos o etapas de desarrollo deseados . [52]
La edición del genoma utiliza nucleasas diseñadas artificialmente que crean roturas bicatenarias específicas en ubicaciones deseadas del genoma. Las roturas están sujetas a procesos de reparación del ADN celular que pueden aprovecharse para eliminar, corregir o insertar genes específicos a altas frecuencias. Si está presente un ADN donante que contiene la secuencia apropiada (homologías), entonces el nuevo material genético que contiene el transgén se integrará en el sitio objetivo con alta eficiencia mediante recombinación homóloga . [53] Hay cuatro familias de nucleasas diseñadas: meganucleasas , [54] [55] ZFN , [56] [57] nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), [58] [59] la CRISPR/Cas (agrupada Repetición palindrómica corta regularmente intercalada/proteína asociada a CRISPR (por ejemplo, CRISPR/Cas9) [ 60] [61] Entre los cuatro tipos, TALEN y CRISPR/Cas son los dos más utilizados [62] Los avances recientes han buscado combinar múltiples sistemas para. explotar las mejores características de ambos (por ejemplo, megaTAL que es una fusión de un dominio de unión al ADN de TALE y una meganucleasa [63] La investigación reciente también se ha centrado en el desarrollo de estrategias para crear correcciones o desactivaciones genéticas sin crear roturas de doble cadena (base ). editores ).
Las meganucleasas se utilizaron por primera vez en 1988 en células de mamíferos. [64] Las meganucleasas son endodesoxirribonucleasas que funcionan como enzimas de restricción con sitios de reconocimiento largos, lo que las hace más específicas de su sitio objetivo que otras enzimas de restricción . Esto aumenta su especificidad y reduce su toxicidad, ya que no se dirigirán a tantos sitios dentro de un genoma. Las meganucleasas más estudiadas son la familia LAGLIDADG . Si bien las meganucleasas siguen siendo bastante susceptibles a la unión fuera del objetivo, lo que las hace menos atractivas que otras herramientas de edición de genes, su tamaño más pequeño aún las hace atractivas, especialmente para las perspectivas de vectorización viral. [65] [53]
Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN), utilizadas por primera vez en 1996, generalmente se crean mediante la fusión de dominios con dedos de zinc y el dominio de nucleasa Fok I. Por tanto, las ZFN tienen la capacidad de escindir el ADN en sitios diana. [53] Al diseñar el dominio del dedo de zinc para apuntar a un sitio específico dentro del genoma, es posible editar la secuencia genómica en la ubicación deseada . [65] [66] [53] Las ZFN tienen una mayor especificidad, pero aún tienen el potencial de unirse a secuencias no específicas. Si bien una cierta cantidad de escisión fuera del objetivo es aceptable para crear organismos modelo transgénicos, es posible que no lo sean. Óptimo para todos los tratamientos de terapia génica humana. [sesenta y cinco]
El acceso al código que rige el reconocimiento del ADN mediante efectores similares a activadores de la transcripción (TALE) en 2009 abrió el camino al desarrollo de una nueva clase de herramientas eficientes de edición de genes basadas en TAL. TALE, proteínas secretadas por el patógeno vegetal Xanthomonas, se unen con gran especificidad a genes dentro de la planta huésped e inician la transcripción de los genes que ayudan a la infección. La ingeniería de TALE mediante la fusión del núcleo de unión del ADN con el dominio catalítico de la nucleasa Fok I permitió la creación de una nueva herramienta de nucleasas de diseño, la nucleasa TALE (TALEN). [67] Tienen una de las mayores especificidades de todas las nucleasas diseñadas actualmente. Debido a la presencia de secuencias repetidas, son difíciles de construir mediante procedimientos estándar de biología molecular y dependen de métodos más complicados como la clonación Golden Gate . [62]
En 2011, se desarrolló otra tecnología innovadora importante basada en sistemas CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas/proteína asociada a CRISPR) que funcionan como un sistema inmunológico adaptativo en bacterias y arqueas . El sistema CRISPR/Cas permite a las bacterias y arqueas luchar contra los virus invasores escindiendo el ADN viral e insertando fragmentos de ese ADN en su propio genoma. Luego, el organismo transcribe este ADN en ARN y lo combina con proteínas Cas9 para realizar roturas de doble cadena en el ADN viral invasor. El ARN sirve como ARN guía para dirigir la enzima Cas9 al lugar correcto en el ADN del virus. Al emparejar las proteínas Cas con un ARN guía diseñado, se puede utilizar CRISPR/Cas9 para inducir roturas de doble cadena en puntos específicos dentro de las secuencias de ADN. La rotura se repara mediante enzimas reparadoras del ADN celular, creando una pequeña mutación de tipo inserción/deleción en la mayoría de los casos. La reparación dirigida del ADN es posible proporcionando una plantilla de ADN donante que representa el cambio deseado y que (a veces) se utiliza para la reparación de roturas de doble hebra mediante recombinación homóloga. Más tarde se demostró que CRISPR/Cas9 puede editar células humanas en una placa. Aunque la primera generación carece de la especificidad de TALEN, la principal ventaja de esta tecnología es la simplicidad del diseño. También permite apuntar a múltiples sitios simultáneamente, lo que permite la edición de múltiples genes a la vez. CRISPR/Cpf1 es un sistema descubierto más recientemente que requiere un ARN guía diferente para crear roturas bicatenarias particulares (deja salientes al escindir el ADN) en comparación con CRISPR/Cas9. [62]
CRISPR/Cas9 es eficaz en la alteración genética. La creación de bebés resistentes al VIH por parte del investigador chino He Jiankui es quizás el ejemplo más famoso de alteración genética utilizando este método. [68] Es mucho menos eficaz en la corrección genética. Se están desarrollando métodos de edición de bases en los que se utiliza una endonucleasa Cas 9 “nucleasa muerta” o una enzima relacionada para seleccionar genes, mientras que una enzima desaminasa vinculada realiza un cambio de base específico en el ADN. [69] El refinamiento más reciente de CRISPR-Cas9 se llama Prime Editing. Este método vincula una transcriptasa inversa a una nucleasa diseñada por ARN que solo realiza cortes de una sola hebra pero no roturas de doble hebra. Reemplaza la porción de ADN próxima al corte mediante la acción sucesiva de la nucleasa y la transcriptasa inversa, introduciendo el cambio deseado a partir de una plantilla de ARN. [70]