La agroinfiltración es un método utilizado en biología vegetal y especialmente últimamente en biotecnología vegetal para inducir la expresión transitoria de genes en una planta , o en hojas aisladas de una planta, o incluso en cultivos de células vegetales, con el fin de producir una proteína deseada . En el método, se introduce una suspensión de Agrobacterium tumefaciens en una hoja de la planta mediante inyección directa o mediante infiltración al vacío, o se asocia con células vegetales inmovilizadas en un soporte poroso (paquetes de células vegetales), [1] tras lo cual las bacterias transfieren el gen deseado a las células vegetales mediante transferencia de T-ADN . El principal beneficio de la agroinfiltración en comparación con la transformación de plantas más tradicional es la velocidad y la conveniencia, aunque los rendimientos de la proteína recombinante son generalmente también más altos y más consistentes.
El primer paso es introducir un gen de interés en una cepa de Agrobacterium tumefaciens . Posteriormente, la cepa se cultiva en un cultivo líquido y las bacterias resultantes se lavan y se suspenden en una solución tampón adecuada . Para la inyección, esta solución se coloca luego en una jeringa (sin aguja). La punta de la jeringa se presiona contra la parte inferior de una hoja mientras se aplica simultáneamente una contrapresión suave en el otro lado de la hoja. Luego, la suspensión de Agrobacterium se inyecta en los espacios aéreos dentro de la hoja a través de los estomas o, a veces, a través de una pequeña incisión realizada en la parte inferior de la hoja.
La infiltración al vacío es otra forma de introducir Agrobacterium en el tejido de las plantas. En este procedimiento, se sumergen los discos de hojas, las hojas o la planta entera en un vaso que contiene la solución y se coloca el vaso en una cámara de vacío. Luego se aplica el vacío, lo que obliga a que el aire salga de los espacios intercelulares dentro de las hojas a través de los estomas. Cuando se libera el vacío, la diferencia de presión hace que la suspensión de "Agrobacterium" entre en las hojas a través de los estomas hasta el tejido del mesófilo . Esto puede hacer que casi todas las células de una hoja determinada entren en contacto con la bacteria.
Una vez dentro de la hoja, la Agrobacterium permanece en el espacio intercelular y transfiere el gen de interés como parte del T-ADN derivado del plásmido Ti en un gran número de copias a las células de la planta. La transferencia de genes ocurre cuando se inducen las señales de la planta y se establece contacto físico entre las células de la planta y las bacterias. Las bacterias crean un mecanismo que excava un agujero y transfiere la nueva cadena de T-ADN a la célula de la planta. El T-ADN se mueve hacia el núcleo de la planta y comienza a integrarse en el cromosoma de la planta. Luego, el gen se expresa transitoriamente a través de la síntesis de ARN a partir de secuencias promotoras apropiadas en todas las células transfectadas (no se realiza ninguna selección para la integración estable). La planta puede monitorearse para detectar un posible efecto en el fenotipo , someterse a condiciones experimentales o cosecharse y usarse para la purificación de la proteína de interés. Muchas especies de plantas pueden procesarse utilizando este método, pero las más comunes son Nicotiana benthamiana y, con menos frecuencia, Nicotiana tabacum .
La expresión transitoria en paquetes de células vegetales cultivadas es un nuevo procedimiento, patentado recientemente por el Instituto Fraunhofer IVV, Alemania. [2] Para esta técnica, las células de tabaco cultivadas en suspensión (por ejemplo: líneas celulares NT1 o BY2 de Nicotiana tabacum ) se inmovilizan por filtración sobre un soporte poroso para formar un paquete de células bien aireado, luego se incuban con Agrobacterium recombinante durante un tiempo para permitir la transferencia de T-ADN, antes de la refiltración para eliminar el exceso de bacterias y líquido. La incubación del paquete de células en un entorno húmedo durante períodos de tiempo de hasta varios días permite la expresión transitoria de proteínas. Las proteínas secretadas se pueden eliminar del paquete de células mediante la aplicación de tampón y filtración adicional.
Es bastante común coinfiltrar el Agrobacterium que porta el constructo de interés junto con otro Agrobacterium que porta un gen de proteína supresora de silenciamiento como el que codifica la proteína p19 del virus fitopatógeno del enanismo arbustivo del tomate (TBSV), o la proteína NSs [3] del virus del marchitamiento manchado del tomate (TSWV). El TBSV se descubrió por primera vez en 1935 en tomates y da como resultado plantas con crecimiento atrofiado y frutos deformados. El TSWV se descubrió en tomates en Australia en 1915, y durante muchos años fue el único miembro de lo que ahora se conoce como género Tospovirus , familia Bunyaviridae .
Para defenderse de los virus y otros patógenos que introducen ácidos nucleicos extraños en sus células, las plantas han desarrollado un sistema de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) en el que se producen pequeños ARN interferentes a partir de ARN bicatenario para crear una vía de degradación específica de secuencia que silencia eficazmente los genes no nativos. [4] [5] Muchos virus de plantas han desarrollado mecanismos que contrarrestan los sistemas PTGS de las plantas mediante la evolución de proteínas, como p19 y NS, que interfieren con la vía PTGS en diferentes niveles. [6] [7] [8]
Aunque no está claro exactamente cómo funciona p19 para suprimir el silenciamiento del ARN, los estudios han demostrado que las proteínas expresadas transitoriamente en las hojas de Nicotiana benthamiana tienen un rendimiento hasta 50 veces mayor cuando se coinfiltran con p19 de TBSV. [9] [10]
Se ha demostrado que el TSWV y otras proteínas NSs del tospovirus son eficaces como supresores del silenciamiento tanto local como sistémico [11] y pueden ser una alternativa útil al p19 cuando se ha demostrado que este último no es eficaz. En otros estudios, se ha demostrado que el p19 del virus de la arruga moteada de la alcachofa tiene un efecto similar, aunque más débil, al p19 del TBSV [12] .