Los lipopolisacáridos ( LPS ) son moléculas grandes formadas por un lípido y un polisacárido que son toxinas bacterianas . Están compuestos por un antígeno O , un núcleo externo y un núcleo interno, todos unidos por enlaces covalentes , y se encuentran en la cápsula bacteriana , la membrana más externa de la envoltura celular de las bacterias gramnegativas, como E. coli y Salmonella. . [1] Hoy en día, el término endotoxina se utiliza a menudo como sinónimo de LPS, [2] aunque hay algunas endotoxinas (en el sentido original de toxinas que se encuentran dentro de la célula bacteriana y que se liberan cuando la célula se desintegra) que no están relacionadas con LPS, como las llamadas proteínas endotoxinas delta producidas por Bacillus thuringiensis . [3]
Los lipopolisacáridos pueden tener impactos sustanciales en la salud humana, principalmente a través de interacciones con el sistema inmunológico. El LPS es un potente activador del sistema inmunológico y pirógeno (agente que provoca fiebre). [4] En casos graves, el LPS puede desempeñar un papel en la causa del shock séptico . [5] En niveles más bajos y durante un período de tiempo más largo, hay evidencia de que el LPS puede desempeñar un papel importante y dañino en la autoinmunidad , la obesidad , la depresión y la senescencia celular . [6] [7] [8] [9]
La actividad tóxica del LPS fue descubierta por primera vez y denominada endotoxina por Richard Friedrich Johannes Pfeiffer . Distinguió entre exotoxinas , toxinas que las bacterias liberan al entorno circundante, y endotoxinas, que son toxinas "dentro" de la célula bacteriana y se liberan sólo después de la destrucción de la membrana externa bacteriana. [10] Trabajos posteriores demostraron que la liberación de LPS de microbios gram negativos no necesariamente requiere la destrucción de la pared celular bacteriana, sino que el LPS se secreta como parte de la actividad fisiológica normal del tráfico de vesículas de membrana en forma de membrana externa bacteriana. vesículas (OMV) , que también pueden contener otros factores de virulencia y proteínas. [11] [1]
El LPS es un componente importante de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas , contribuyendo en gran medida a la integridad estructural de las bacterias y protegiendo la membrana de ciertos tipos de ataques químicos. El LPS es el antígeno más abundante en la superficie celular de la mayoría de las bacterias Gram negativas y contribuye hasta el 80% de la membrana externa de E. coli y Salmonella . [1] El LPS aumenta la carga negativa de la membrana celular y ayuda a estabilizar la estructura general de la membrana. Es de crucial importancia para muchas bacterias Gram negativas, que mueren si los genes que lo codifican se mutan o se eliminan. Sin embargo, parece que el LPS no es esencial al menos en algunas bacterias Gram negativas, como Neisseria meningitidis , Moraxella catarrhalis y Acinetobacter baumannii . [12] También se ha implicado en aspectos no patógenos de la ecología bacteriana, incluida la adhesión a la superficie, la sensibilidad de los bacteriófagos y las interacciones con depredadores como las amebas . El LPS también es necesario para el funcionamiento de omptins , una clase de proteasa bacteriana. [13]
Los lipopolisacáridos se componen de tres partes: el antígeno O (u polisacárido O), el oligosacárido central y el lípido A.
El polímero de glicano repetitivo contenido dentro de un LPS se denomina antígeno O , polisacárido O o cadena lateral O de la bacteria. El antígeno O está unido al oligosacárido central y comprende el dominio más externo de la molécula de LPS. La composición de la cadena O varía de una cepa a otra; Hay más de 160 estructuras diferentes del antígeno O producidas por diferentes cepas de E. coli . [14] La presencia o ausencia de cadenas O determina si el LPS se considera "áspero" o "liso". Las cadenas O de longitud completa harían que el LPS fuera suave, mientras que la ausencia o reducción de cadenas O haría que el LPS fuera áspero. [15] Las bacterias con LPS rugoso suelen tener membranas celulares más penetrables que los antibióticos hidrofóbicos, ya que un LPS rugoso es más hidrofóbico . [16] El antígeno O está expuesto en la superficie más externa de la célula bacteriana y, como consecuencia, es un objetivo para el reconocimiento de los anticuerpos del huésped .
El dominio central siempre contiene un componente oligosacárido que se une directamente al lípido A y comúnmente contiene azúcares como heptosa y ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico (también conocido como KDO, cetodesoxioctulosonato). [17] Los núcleos de LPS de muchas bacterias también contienen componentes que no son carbohidratos, como fosfato, aminoácidos y sustituyentes de etanolamina.
El lípido A es, en circunstancias normales, un disacárido de glucosamina fosforilado decorado con múltiples ácidos grasos . Estas cadenas de ácidos grasos hidrofóbicos anclan el LPS a la membrana bacteriana y el resto del LPS se proyecta desde la superficie celular. El dominio del lípido A es responsable de gran parte de la toxicidad de las bacterias Gram-negativas . Cuando el sistema inmunológico lisa las células bacterianas , se liberan a la circulación fragmentos de membrana que contienen lípido A, lo que provoca fiebre, diarrea y un posible shock endotóxico mortal (también llamado shock séptico ). La fracción Lípido A es un componente muy conservado del LPS. [18] Sin embargo, la estructura del lípido A varía entre las especies bacterianas. La estructura del lípido A define en gran medida el grado y la naturaleza de la activación inmune general del huésped. [19]
La "forma rugosa" del LPS tiene un peso molecular más bajo debido a la ausencia del polisacárido O. En su lugar hay un oligosacárido corto: esta forma se conoce como Lipooligosacárido (LOS), y es un glicolípido que se encuentra en la membrana externa de algunos tipos de bacterias Gram-negativas , como Neisseria spp. y Haemophilus spp. [6] [20] LOS desempeña un papel central en el mantenimiento de la integridad y funcionalidad de la membrana externa de la envoltura de las células Gram negativas . LOS juegan un papel importante en la patogénesis de ciertas infecciones bacterianas porque son capaces de actuar como inmunoestimuladores e inmunomoduladores. [6] Además, las moléculas LOS son responsables de la capacidad de algunas cepas bacterianas para mostrar mimetismo molecular y diversidad antigénica , ayudando en la evasión de las defensas inmunes del huésped y contribuyendo así a la virulencia de estas cepas bacterianas . En el caso de Neisseria meningitidis , la porción de lípido A de la molécula tiene una estructura simétrica y el núcleo interno está compuesto por restos de ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico (KDO) y heptosa (Hep). La cadena de oligosacáridos del núcleo externo varía según la cepa bacteriana . [6] [20]
Una enzima del huésped altamente conservada llamada aciloxiacil hidrolasa (AOAH) puede desintoxicar el LPS cuando ingresa o se produce en los tejidos animales. También puede convertir el LPS en el intestino en un inhibidor de LPS. Los neutrófilos, macrófagos y células dendríticas producen esta lipasa, que inactiva el LPS eliminando las dos cadenas de acilo secundarias del lípido A para producir tetraacil LPS. Si los ratones reciben LPS por vía parenteral, aquellos que carecen de AOAH desarrollan títulos elevados de anticuerpos no específicos, desarrollan hepatomegalia prolongada y experimentan tolerancia prolongada a las endotoxinas. Es posible que se requiera la inactivación de LPS para que los animales restablezcan la homeostasis después de la exposición parenteral a LPS. [21] Aunque los ratones tienen muchos otros mecanismos para inhibir la señalización de LPS, ninguno es capaz de prevenir estos cambios en animales que carecen de AOAH.
La desfosforilación del LPS por la fosfatasa alcalina intestinal puede reducir la gravedad de la infección por Salmonella tryphimurium y Clostridioides difficile y restaurar la microbiota intestinal normal. [22] La fosfatasa alcalina previene la inflamación intestinal (y el " intestino permeable ") causada por bacterias al desfosforilar la porción del lípido A del LPS. [23] [24] [25]
Todo el proceso de producción de LPS comienza con una molécula llamada lípido A-Kdo2, que se crea primero en la superficie de la membrana interna de la célula bacteriana. Luego, se agregan azúcares adicionales a esta molécula en la membrana interna antes de que se mueva al espacio entre las membranas interna y externa ( espacio periplásmico ) con la ayuda de una proteína llamada MsbA. El antígeno O, otra parte del LPS, se produce mediante complejos enzimáticos especiales en la membrana interna. Luego se mueve a la membrana externa a través de tres sistemas diferentes: uno depende de Wzy, otro depende de los transportadores ABC y el tercero implica un proceso dependiente de la sintasa. [28]
En última instancia, el LPS se transporta a la membrana externa mediante un puente de membrana a membrana de proteínas de transporte de lipolisacáridos (Lpt). [27] [29] Este transportador es un posible objetivo antibiótico. [30] [31]
El LPS actúa como la endotoxina prototípica porque se une al complejo receptor CD14 / TLR4 / MD2 en muchos tipos de células, pero especialmente en monocitos , células dendríticas , macrófagos y células B , lo que promueve la secreción de citoquinas proinflamatorias , óxido nítrico y eicosanoides. . [32] Bruce Beutler recibió una parte del Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2011 por su trabajo que demuestra que TLR4 es el receptor de LPS. [33] [34]
Como parte de la respuesta celular al estrés , el superóxido es una de las principales especies reactivas de oxígeno inducidas por LPS en varios tipos de células que expresan TLR ( receptor tipo peaje ). [35] El LPS también es un pirógeno exógeno (sustancia que induce fiebre). [4]
La función del LPS ha estado bajo investigación experimental durante varios años debido a su papel en la activación de muchos factores de transcripción . El LPS también produce muchos tipos de mediadores implicados en el shock séptico . Los humanos son mucho más sensibles al LPS que otros animales (p. ej., ratones). Una dosis de 1 µg/kg induce shock en humanos, pero los ratones tolerarán una dosis hasta mil veces mayor. [36] Esto puede estar relacionado con diferencias en el nivel de anticuerpos naturales circulantes entre las dos especies. [37] [38] Dijo y col. demostraron que el LPS causa una inhibición dependiente de IL-10 de la expansión y función de las células T CD4 al regular positivamente los niveles de PD-1 en los monocitos , lo que conduce a la producción de IL-10 por parte de los monocitos después de la unión de PD-1 por PD-L1 . [39]
Las endotoxinas son en gran parte responsables de las dramáticas manifestaciones clínicas de las infecciones por bacterias patógenas Gram-negativas, como Neisseria meningitidis , el patógeno que causa la enfermedad meningocócica , incluida la meningococemia , el síndrome de Waterhouse-Friderichsen y la meningitis .
Se ha demostrado que porciones de LPS de varias cepas bacterianas son químicamente similares a las moléculas de la superficie de la célula huésped humana; La capacidad de algunas bacterias para presentar moléculas en su superficie que son químicamente idénticas o similares a las moléculas de la superficie de algunos tipos de células huésped se denomina mimetismo molecular . [40] Por ejemplo, en Neisseria meningitidis L2,3,5,7,9, la porción tetrasacárido terminal del oligosacárido (lacto-N-neotetraosa) es el mismo tetrasacárido que se encuentra en el paraglobósido, un precursor de los antígenos glicolípidos ABH encontrados. sobre eritrocitos humanos . [6] En otro ejemplo, la porción terminal de trisacárido (lactotriaosa) del oligosacárido de Neisseria spp. LOS también se encuentra en glicoesfingolípidos de la serie lactoneos de células humanas. [6] Se ha demostrado que la mayoría de los meningococos de los grupos B y C, así como los gonococos , tienen este trisacárido como parte de su estructura LOS. [6] La presencia de estos 'imitadores' de la superficie de las células humanas puede, además de actuar como un 'camuflaje' del sistema inmunológico, desempeñar un papel en la abolición de la tolerancia inmunológica al infectar huéspedes con ciertos genotipos del antígeno leucocitario humano (HLA). , como HLA-B35 . [6]
El LPS puede ser detectado directamente por las células madre hematopoyéticas (HSC) a través de la unión con TLR4, lo que hace que proliferen en reacción a una infección sistémica. Esta respuesta activa la señalización TLR4-TRIF-ROS-p38 dentro de las HSC y, a través de una activación sostenida de TLR4, puede causar un estrés proliferativo, lo que perjudica su capacidad de repoblación competitiva. [41] La infección en ratones utilizando S. typhimurium mostró resultados similares, validando el modelo experimental también in vivo .
Los antígenos O (los carbohidratos externos) son la porción más variable de la molécula de LPS y confieren especificidad antigénica. Por el contrario, el lípido A es la parte más conservada. Sin embargo, la composición del lípido A también puede variar (por ejemplo, en el número y naturaleza de las cadenas de acilo incluso dentro o entre géneros). Algunas de estas variaciones pueden impartir propiedades antagónicas a estos LPS. Por ejemplo, el difosforil lípido A de Rhodobacter sphaeroides (RsDPLA) es un potente antagonista del LPS en células humanas, pero es un agonista en células de hámster y equino. [42]
Se ha especulado que el lípido A cónico (p. ej., de E. coli ) es más agonista, mientras que el lípido A menos cónico como el de Porphyromonas gingivalis puede activar una señal diferente ( TLR2 en lugar de TLR4), y el lípido A completamente cilíndrico como el de Rhodobacter sphaeroides es antagonista de los TLR. [43] [44] En general, los grupos de genes LPS son muy variables entre diferentes cepas, subespecies y especies de bacterias patógenas de plantas y animales. [45] [46]
El suero sanguíneo humano normal contiene anticuerpos anti-LOS que son bactericidas y los pacientes que padecen infecciones causadas por cepas serotípicamente distintas poseen anticuerpos anti-LOS que difieren en su especificidad en comparación con el suero normal. [47] Estas diferencias en la respuesta inmune humoral a diferentes tipos de LOS se pueden atribuir a la estructura de la molécula de LOS, principalmente dentro de la estructura de la porción de oligosacárido de la molécula de LOS. [47] En Neisseria gonorrhoeae se ha demostrado que la antigenicidad de las moléculas de LOS puede cambiar durante una infección debido a la capacidad de estas bacterias para sintetizar más de un tipo de LOS, [47] una característica conocida como variación de fase . Además, Neisseria gonorrhoeae , así como Neisseria meningitidis y Haemophilus influenzae , [6] son capaces de modificar aún más su LOS in vitro , por ejemplo mediante sialilación (modificación con residuos de ácido siálico) y, como resultado, pueden aumentar su resistencia a muerte mediada por el complemento [47] o incluso regular negativamente la activación del complemento [6] o evadir los efectos de los anticuerpos bactericidas . [6] La sialilación también puede contribuir a dificultar la unión de neutrófilos y la fagocitosis por parte de las células del sistema inmunológico, así como a una reducción del estallido oxidativo. [6] También se ha demostrado que Haemophilus somnus , un patógeno del ganado vacuno, muestra una variación de la fase LOS, una característica que puede ayudar a evadir las defensas inmunitarias del huésped bovino . [48] En conjunto, estas observaciones sugieren que las variaciones en las moléculas de la superficie bacteriana, como LOS, pueden ayudar al patógeno a evadir las defensas inmunes del huésped tanto humorales (mediadas por anticuerpos y complemento) como celulares (muerte por neutrófilos, por ejemplo).
Recientemente, se demostró que, además de las vías mediadas por TLR4 , ciertos miembros de la familia de canales iónicos potenciales de receptores transitorios reconocen el LPS. [49] La activación de TRPA1 mediada por LPS se demostró en ratones [50] y en moscas Drosophila melanogaster . [51] En concentraciones más altas, el LPS también activa otros miembros de la familia de canales sensoriales TRP , como TRPV1 , TRPM3 y, hasta cierto punto, TRPM8 . [52] El TRPV4 reconoce el LPS en las células epiteliales. La activación de TRPV4 por LPS fue necesaria y suficiente para inducir la producción de óxido nítrico con efecto bactericida. [53]
El lipopolisacárido es un factor importante que hace que las bacterias sean dañinas y ayuda a clasificarlas en diferentes grupos según su estructura y función. Esto convierte al LPS en un marcador útil para diferenciar varias bacterias Gram negativas. Identificar y comprender rápidamente los tipos de patógenos involucrados es crucial para controlar y tratar rápidamente las infecciones. Dado que el LPS es el principal desencadenante de la respuesta inmunitaria de nuestras células, actúa como una señal temprana de una infección aguda. Por lo tanto, la prueba de LPS es más específica y significativa que muchas otras pruebas serológicas. [54]
Los métodos actuales para probar LPS son bastante sensibles, pero muchos de ellos tienen dificultades para diferenciar entre diferentes grupos de LPS. Además, la naturaleza del LPS, que tiene propiedades tanto de atracción como de repelencia del agua (anfifílica), dificulta el desarrollo de pruebas sensibles y fáciles de usar. [54]
Los métodos de detección típicos se basan en la identificación de la parte del lípido A del LPS. Sin embargo, este método tiene limitaciones porque el lípido A es muy similar entre diferentes especies y serotipos bacterianos. Las técnicas de prueba de LPS se dividen en seis categorías y, a menudo, se superponen: pruebas in vivo, pruebas in vitro, inmunoensayos modificados, ensayos biológicos y ensayos químicos. [54]
El LPS es una poderosa toxina que, cuando está en el cuerpo, desencadena inflamación al unirse a receptores celulares. El exceso de LPS en la sangre puede provocar endotoxemia, lo que podría provocar una afección dañina llamada shock séptico. Esta afección incluye síntomas como frecuencia cardíaca rápida, respiración rápida, cambios de temperatura y problemas de coagulación de la sangre, lo que provoca que los vasos sanguíneos se ensanchen y se reduzca el volumen sanguíneo, lo que provoca una disfunción celular. [54]
Investigaciones recientes indican que incluso una pequeña exposición al LPS está asociada con enfermedades autoinmunes y alergias. Los niveles altos de LPS en la sangre pueden provocar síndrome metabólico, aumentando el riesgo de enfermedades como diabetes, enfermedades cardíacas y problemas hepáticos. [54]
El LPS también juega un papel crucial en los síntomas causados por infecciones por bacterias dañinas, incluidas afecciones graves como el síndrome de Waterhouse-Friderichsen, la meningococemia y la meningitis. Ciertas bacterias pueden adaptar su LPS para provocar infecciones duraderas en los sistemas respiratorio y digestivo. [54]
Estudios recientes han demostrado que el LPS altera los lípidos de la membrana celular, afectando el colesterol y el metabolismo, lo que podría provocar colesterol alto, niveles anormales de lípidos en sangre y enfermedad del hígado graso no alcohólico. En algunos casos, el LPS puede interferir con la eliminación de toxinas, lo que puede estar relacionado con problemas neurológicos. [54]
En general, los efectos del LPS sobre la salud se deben a sus capacidades como potente activador y modulador del sistema inmunológico, especialmente a su inducción de inflamación.
La presencia de endotoxinas en la sangre se llama endotoxemia. Un nivel alto de endotoxemia puede provocar un shock séptico , [55] mientras que una concentración más baja de endotoxinas en el torrente sanguíneo se denomina endotoxemia metabólica. [56] La endotoxemia se asocia con la obesidad, la dieta, [57] las enfermedades cardiovasculares, [57] y la diabetes, [56] mientras que la genética del huésped también podría tener un efecto. [58]
Además, la endotoxemia de origen intestinal, especialmente en la interfaz huésped-patógeno , se considera un factor importante en el desarrollo de la hepatitis alcohólica, [59] que probablemente se desarrolle sobre la base del síndrome de sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado y una aumento de la permeabilidad intestinal . [60]
El lípido A puede provocar una activación incontrolada del sistema inmunológico de los mamíferos con producción de mediadores inflamatorios que pueden provocar un shock séptico . [20] Esta reacción inflamatoria está mediada por el receptor tipo Toll 4, que es responsable de la activación de las células del sistema inmunológico. [20] El daño a la capa endotelial de los vasos sanguíneos causado por estos mediadores inflamatorios puede provocar el síndrome de fuga capilar , dilatación de los vasos sanguíneos y una disminución de la función cardíaca y puede provocar un shock séptico . [61] También se puede observar una activación pronunciada del complemento más adelante en el curso a medida que las bacterias se multiplican en la sangre. [61] La alta proliferación bacteriana que desencadena un daño endotelial destructivo también puede conducir a una coagulación intravascular diseminada (CID) con pérdida de función de ciertos órganos internos como los riñones, las glándulas suprarrenales y los pulmones debido al compromiso del suministro de sangre. La piel puede mostrar los efectos del daño vascular, a menudo junto con el agotamiento de los factores de coagulación en forma de petequias , púrpura y equimosis . Las extremidades también pueden verse afectadas, en ocasiones con consecuencias devastadoras como el desarrollo de gangrena , requiriendo una posterior amputación . [61] La pérdida de función de las glándulas suprarrenales puede causar insuficiencia suprarrenal y una hemorragia adicional en las glándulas suprarrenales causa el síndrome de Waterhouse-Friderichsen , los cuales pueden poner en peligro la vida.
También se ha informado que la LOS gonocócica puede causar daño a las trompas de Falopio humanas . [47]
Se cree que el mimetismo molecular de algunas moléculas LOS provoca respuestas autoinmunes del huésped, como brotes de esclerosis múltiple . [6] [40] Otros ejemplos de mimetismo bacteriano de las estructuras del huésped a través de LOS se encuentran en las bacterias Helicobacter pylori y Campylobacter jejuni , organismos que causan enfermedades gastrointestinales en humanos, y Haemophilus ducreyi , que causa chancroide . Ciertos serotipos de LPS de C. jejuni (atribuidos a ciertos restos tetra y pentasacáridos del oligosacárido central) también se han implicado con el síndrome de Guillain-Barré y una variante de Guillain-Barré llamada síndrome de Miller-Fisher . [6]
Los estudios epidemiológicos han demostrado que el aumento de la carga de endotoxinas, que puede ser el resultado de un aumento de las poblaciones de bacterias productoras de endotoxinas en el tracto intestinal, está asociado con ciertos grupos de pacientes relacionados con la obesidad. [7] [62] [63] Otros estudios han demostrado que la endotoxina purificada de Escherichia coli puede inducir obesidad y resistencia a la insulina cuando se inyecta en modelos de ratón libres de gérmenes . [64] Un estudio más reciente ha descubierto un papel potencialmente contribuyente de Enterobacter cloacae B29 hacia la obesidad y la resistencia a la insulina en un paciente humano. [65] El supuesto mecanismo para la asociación de la endotoxina con la obesidad es que la endotoxina induce una vía mediada por la inflamación que explica la obesidad y la resistencia a la insulina observadas. [64] Los géneros bacterianos asociados con los efectos de la obesidad relacionados con las endotoxinas incluyen Escherichia y Enterobacter .
Existe evidencia experimental y observacional de que el LPS podría desempeñar un papel en la depresión. La administración de LPS en ratones puede provocar síntomas depresivos y parece haber niveles elevados de LPS en algunas personas con depresión. En ocasiones, la inflamación puede desempeñar un papel en el desarrollo de la depresión y el LPS es proinflamatorio. [8]
La inflamación inducida por LPS puede inducir senescencia celular , como se ha demostrado en el caso de las células epiteliales del pulmón y las células microgliales (estas últimas conducen a la neurodegeneración ). [9]
Los lipopolisacáridos son contaminantes frecuentes en el ADN plasmídico preparado a partir de bacterias o proteínas expresadas a partir de bacterias, y deben eliminarse del ADN o la proteína para evitar contaminar los experimentos y evitar la toxicidad de los productos fabricados mediante fermentación industrial . [66]
La ovoalbúmina suele estar contaminada con endotoxinas. La ovoalbúmina es una de las proteínas ampliamente estudiadas en modelos animales y también un alérgeno modelo establecido para la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR). La ovoalbúmina disponible comercialmente que está contaminada con LPS puede falsificar los resultados de la investigación, ya que no refleja con precisión el efecto del antígeno proteico en la fisiología animal. [67]
En la producción farmacéutica, es necesario eliminar todos los rastros de endotoxina de los envases de los productos farmacéuticos, ya que incluso pequeñas cantidades de endotoxina causarán enfermedades en los humanos. Para ello se utiliza un horno de despirogenación . Se requieren temperaturas superiores a 300 °C para descomponer completamente el LPS. [68]
El ensayo estándar para detectar la presencia de endotoxina es el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus (LAL), que utiliza sangre del cangrejo herradura ( Limulus polyphemus ). [69] Niveles muy bajos de LPS pueden causar la coagulación del lisado de Limulus debido a una poderosa amplificación a través de una cascada enzimática. Sin embargo, debido a la disminución de la población de cangrejos herradura y al hecho de que existen factores que interfieren con el ensayo LAL, se han realizado esfuerzos para desarrollar ensayos alternativos, siendo los más prometedores las pruebas ELISA que utilizan una versión recombinante de una proteína en el ensayo LAL, factor C. [70]