Debutó en el cine con diecisiete años, en la película ...e Napoli canta (1953), y obtuvo su primer éxito junto a Totò en Questa è la vita (1954).

En 1963 rechazó el papel de chica Bond en Desde Rusia con amor, protagonizada por Sean Connery; su personaje lo haría finalmente Daniela Bianchi.

Rehusó posar desnuda para la revista Playboy y se cuenta que también rechazó el papel protagonista del filme Barbarella de Roger Vadim, decidiendo regresar a Europa.

La rescisión de su contrato con la Paramount causó problemas a Virna Lisi: se vio inmersa en un litigio y tuvo que pagar una multa.

Su regreso a Italia no la alejó del cine internacional, ya que este país acogía entonces los rodajes de muchas coproducciones.

En 1974-75 rodó, junto a Franco Nero, dos filmes sobre la novela Colmillo Blanco bajo dirección de Lucio Fulci, tras lo cual redujo su actividad profesional para volcarse en la vida familiar.

Volvió a colaborar con Lattuada en 1985, esta vez para una teleserie sobre Cristóbal Colón con un reparto internacional: Gabriel Byrne, Faye Dunaway, Raf Vallone, Eli Wallach... Entremedias, Virna Lisi ganó otro David de Donatello, esta vez como mejor actriz secundaria, por Sapore di mare de Carlo Vanzina.