Hijo del afamado condottiero Prospero Colonna, no es seguro si su madre era Covella Sanseverino o Isabella Carafa.
Sus primeros años son totalmente desconocidos; encaminado a la carrera de las armas a la sombra de su padre, la primera noticia sobre su persona data del año 1521, cuando tras la muerte del papa León X el Colegio Cardenalicio encargó a Vespasiano y a Prospero que junto con sus rivales los Orsini Ludovico y Lorenzo Gaetano mantuvieran el orden en Roma durante la celebración del cónclave de 1521-22 en que fue elegido Adriano VI.
El conflicto se verificó en 1526 con la toma de Anagni y con el posterior asalto a Roma, dirigido por Vespasiano junto con sus parientes Ascanio y Pompeo, y se agudizó con el saqueo de la ciudad del año siguiente.
Conde de Belgioioso por concesión del emperador Carlos V desde 1524, renunció al título el año siguiente para recibir el ducado de Carpi, al que también renunció en 1528 a cambio de una pingüe indemnización económica.
Contrajo matrimonio dos veces: la primera con Beatrice Appiani (m. 1525), con quien tuvo una sola hija llamada Isabella; la segunda con Giulia Gonzaga, de quien no tuvo descendencia.