Difracción Anómala Múltiple

Se conoce como MAD (Multiwavelength Anomalous Dispersion/Diffraction o Dispersión/Difracción Anómala Múltiple) a una técnica cristalográfica empleada para determinar la estructura de moléculas.Se utiliza principalmente para determinar la estructura de macromoléculas, como las proteínas.El uso de sincrotrones como fuentes de rayos X y el desarrollo teórico y experimental, llevado a cabo por Jerome Karle y Wayne Hendrickson entre otros, resultaron en una notable expansión del método a finales del siglo XX.[1]​[2]​ El físico sueco Ivar Waller fue el primero en predecir teóricamente la dispersión por rayos X en 1928 y en 1933 el alemán Helmut Höln proporcionó los primeros cálculos de la magnitud del efecto.[5]​[6]​ En 1956, Okaya y Pepinsky propusieron explotar la variación de la dispersión con la longitud de onda y Jerome Karle introdujo en 1967 un análisis algebraico del método para determinar la estructura a partir de la dispersión anómala a diferentes longitudes de onda; este análisis fue refinado en 1980; por aquel entonces, se estaban comenzando a habilitar sincrotrones como fuentes de rayos X.Phillips y sus colaboradores reconocieron el potencial para la solución de estructuras de macromoléculas y Wayne Hendrickson realizó aportes claves a la técnica, incluyendo la adopción de un protocolo para sustituir el aminoácido metionina en proteínas recombinantes por seleniometionina; los átomos de selenio exhiben una dispersión anómala fácilmente detectable a las longitudes de onda obtenibles en líneas de luz sincrotrón.[7]​[8]​ Gracias a estos avances la dispersión anómala múltiple ha llegado a ser uno de los métodos más empleados para elucidar nuevas estructuras de macromoléculas.[9]​ El método MAD, al igual que el método relacionado SAD, se basa en las diferencias en intensidad de los rayos X reflejados por un cristal a raíz del fenómeno de la dispersión anómala.Cuando la energía —inversamente proporcional a la longitud de onda— de los rayos X incidentes en un material es diferente a la energía que mantiene a los electrones ligados al núcleo, dichos electrones interactúan con el campo electromagnético como electrones libres; la dispersión elástica conjunta de todos los electrones del átomo, cuantificada por el factor de forma atómica elásticoLa dispersión anómala ocurre cuando la energía de los rayos X es similar a la energía de ligadura de los electrones en un determinado nivel atómico; en este caso, los electrones entran en resonancia con el campo electromagnético, oscilando en fase con este.se conoce como término dispersivo, y la parte imaginariaes la suma del término elástico y el término anómalo: La componente anómala del factor de forma atómico introduce una diferencia en el factor de estructura cristalinopara una reflexión medida a dos longitudes de onda diferentes.Además la parte imaginaria del factor de formaEl efecto es mucho más detectable en cuando las moléculas orgánicas contienen metales u otros átomos pesados, pues la energía de ligadura de los electrones aumenta con el número atómico.Los átomos pesados pueden estar presentes naturalmente o ser incorporados a la molécula mediante técnicas químicas o biológicas; entre estas, la más frecuentemente empleada es la sustitución de los átomos de azufre en el aminoácido metionina por selenio, con parecidas propiedades químicas pero con un salto de absorción a una energía de 12,6 keV, propicia para los experimentos cristalográficos.En la presencia de tales átomos pesados, el factor de estructura total se puede expresar como la suma del factor de estructura correspondientes a todos los átomos ligeros: En el caso más simple en que todos los átomos con dispersión anómala sean del mismo tipo, la intensidad de la reflexión se puede expresar como: Como las amplitudes de los pares Friedelno son equivalentes en la presencia de dispersión anómala, a cada longitud de onda se obtienen dos ecuaciones diferentes para cada reflexión; a dos longitudes de onda se pueden determinar, en principio, las tres cantidades desconocidas[8]​ Cuando las diferencias dispersivas y anómalas son lo suficientemente grandes, las posiciones de los átomos de selenio u otro átomo pesado se pueden calcular por métodos directos o síntesis de Patterson, lo que a su vez permite obtener la fase para la contribución anómala[2]​ Para maximizar las diferencias anómalas en las reflexiones cristalinas, las longitudes de onda para el experimento deben ser aquellas donde las componentes del factor anómalo de formaPara maximizar tando las diferencias anómalas como las diferencias dispersivas deben seleccionarse las siguientes longitudes de onda:[13]​ Para determinar la posición de las longitudes de onda para un cristal determinado se mide la fluorescencia del cristal, directamente proporcional al valor deTambién se miden los pares Friedel o Bijvoet a cada una de las longitudes de onda; dependiendo de la orientación y simetría del cristal, los pares de reflexiones Friedel se pueden medir sin reorientar el cristal, o invirtiendo su posición con una rotación de 180 grados alrededor del eje, práctica conocida como «haz inverso».
Efecto del factor anómalo de forma: El vector FH es la contribución al factor de estructura de un átomo pesado a una longitud de onda con dispersión anómala baja. El vector FHA es el factor de estructura para la misma reflexión cerca de un salto de absorción donde las magnitud del efecto anómalo es mayor. La componente imaginaria del factor anómalo causa un cambio de fase, y ambas componentes alteran la amplitud (igual al módulo del vector) del factor de estructura.
La amplitud de los pares Friedel FT y FT- no es igual en la presencia de absorción por un átomo o grupo de átomos en la molécula, cuya contribución no anómala al factor de estructura está representada por FH. En cambio, en la ausencia de absorción (f" ≈ 0), la amplitud de FPH y FPH es igual.
Valores de y alrededor de un salto de absorción. Los valores de se calculan a partir de la fluorescencia emitida por la muestra a cada energía. Los valores de se obtienen aplicando las ecuaciones de Kramers-Kronig.