Está protagonizada por Marga López, Alicia Caro, Rosaura Revueltas, e Irasema Dilián, en su debut en el cine mexicano.
Manuela, una adolescente, ingresa a un internado católico después de la muerte de su madre.
Ahí tiene problemas para ajustarse a la rígida disciplina de la directora, quien cree fervientemente que el hambre y el rigor afirman el carácter de las niñas.
Manuela, sin embargo, será cuidada por Lucila, la profesora más joven del internado y a la que todas las niñas admiran.
Algunos críticos de cine consideran a Muchachas de uniforme como una película revolucionaria de la cinematografía mexicana por tocar sutilmente el tema de la homosexualidad, específicamente el lesbianismo, en una época en México en que tener preferencias sexuales distintas era mal visto por la sociedad en general, al punto de ser considerado como un «pecado mortal».