Nació en Florencia, donde fue criada por Cosme y Leonor Álvarez de Toledo, su tía del mismo nombre.

[8]​ Lucrecia murió en 1561, dejando a Isabel como única hija sobreviviente de Cosme; el duque fue, sin embargo, muy cariñoso con Leonor, y la trató como a su propia hija, pues estaba prendado por su vivacidad y vigor físico.

La pareja se comprometió en 1568, cuando Leonor tenía quince años, con la aprobación del rey Felipe II.

Aunque Isabel tenía dos niños de Paolo Giordano, ella había optado por no vivir en el castillo de su marido en Bracciano, o en Roma, donde él llevaba a cabo sus asuntos políticos y amorosos.

Leonor se convirtió en parte del círculo de Isabel donde destacaba por su belleza y vivacidad.

Durante el gobierno del libertario Cosme, ese comportamiento era tolerado mientras se mantuviera discreción y los matrimonios cosecharan ventajas políticas.

Los maridos de las respectivas mujeres tenían también sus propias amantes, y los matrimonios vivían largos períodos separados.

Su sucesor, el solitario gran duque Francisco I de Médicis, fue, sin embargo, muy diferente.

[20]​ Once años más joven que Isabel, Leonor era un poco menos prudente en sus aventuras amorosas.

"Anoche, a las seis horas se produjo un accidente con mi esposa y ella murió.

Y si él no hubiera pedido ayuda a dos desgraciados de Romaña, que afirman haber sido convocados allí precisamente para este propósito, quizá le habría ido peor.

"[Ella]... era hermosa, amable, gentil, llegando a ser encantadora, afable", escribió, "y, sobre todo, tenía dos ojos en la cabeza que eran como dos estrellas en su belleza".

[23]​Al principio, el gran duque Francisco dijo que Leonor había muerto de un ataque al corazón.

Le escribió a Felipe II de España, en cuyo favor el título dependía: "Aunque en la carta que había dicho del accidente doña Leonor, no tengo más que decir, a Su Majestad Católica que don Pedro nuestro hermano le había quitado él mismo su vida debido a la traición que ella había cometido a través de la conducta impropia de una dama...

[31]​ Había también una dimensión política en los asesinatos, porque Antinori y otro asociado de Leonor, Pierino Ridolfi, -de acuerdo, al menos a la confesión de Ridolfi bajo tortura- se vieron implicados en una vendetta contra los Medici dirigida por Orazio Pucci.