También se enemistaron con el papa Sixto IV que tras volver a Roma, intentaba reorganizar los Estados Pontificios.

Durante el reinado de Hércules I de Este, Ferrara creció como centro cultural pues en ella vivieron: grandes pintores como Dosso Dossi, Tiziano o Giovanni Bellini y literatos como Ludovico Ariosto, Petrarca o Torquato Tasso.

Alfonso d'Este estuvo casado con Lucrecia Borgia y como ya hizo su padre anteriormente, creó en Ferrara una espléndida corte que atrajo a famosos artistas de la época.

Cuando Enrique II de Francia retomó la actividad militar en la península itálica en 1551, Hércules II apoya al francés, asumiendo el mando de la liga formada por Francia, los Estados Pontificios y Ferrara contra el poder imperial.

Ese año comenzó una decadencia inevitable pues la línea directa de sucesión de la familia Este se acabó y, aunque Alfonso II designó como sucesor a su primo César, el papa Clemente VIII rehusó reconocer los derechos de Este e incorporó Ferrara a los Estados Pontificios.