La sintetasa primero se une a ATP y al correspondiente aminoácido o su precursor para formar un aminoacil-adenilato, liberando una molécula de pirofosfato inorgánico (PPi).

El complejo adenilato-aaRS luego se une la molécula apropiada de ARNt, y el aminoácido se transfiere desde el complejo aminoacil-AMP a un grupo hidroxilo (ya sea 2' o 3') del último nucleótido (A76, en el extremo 3') del ARNt.

Algunas sintetasas también pueden mediar una reacción de corrección de lectura para garantizar una alta fidelidad en la carga del ARNt: si el ARNt se ha unido con un aminoácido incorrecto, la sintetasa puede hidrolizar la unión aminoacil-ARNt.

Estos son dos claros indicios de que se ha producido una transferencia horizontal en varias ocasiones durante la historia evolutiva de las aminoacil-ARNt sintetasas (Carl R. Woese, Gary J. Olsen, Michael Ibba, and Dieter Söll.

En algunas de las aminoacil ARNt sintetasas, la cavidad en la que se une el aminoácido puede mutarse y modificarse para aceptar aminoácidos artificiales, no naturales, sintetizados en laboratorio, con el fin de unirlos a determinados ARNt específicos.