96 pines utilizados para realizar ensayos puntuales con células de levadura, hongos o bacterias
Los microorganismos individuales colocados en la placa crecerán en colonias individuales , cada una de las cuales es un clon genéticamente idéntico al organismo ancestro individual (excepto por la baja e inevitable tasa de mutación ). Por tanto, la placa se puede utilizar para estimar la concentración de organismos en un cultivo líquido o una dilución adecuada de ese cultivo utilizando un contador de colonias , o para generar cultivos genéticamente puros a partir de un cultivo mixto de organismos genéticamente diferentes.
Hay varios métodos disponibles para sembrar células. Una técnica se conoce como " rayado ". En esta técnica, se extiende una gota del cultivo en el extremo de un lazo de alambre delgado y estéril , a veces conocido como inoculador, a lo largo de la superficie del agar, dejando atrás organismos, un número mayor al comienzo de la línea y un número mayor al comienzo de la línea. número más bajo al final. En algún momento durante una "racha" exitosa, el número de organismos depositados será tal que crecerán colonias individuales distintas en esa área que podrán eliminarse para seguir cultivando, utilizando otro asa estéril.
Otra forma de sembrar organismos, además de mediante estrías, en placas de agar es el análisis puntual . Este tipo de análisis se utiliza a menudo para comprobar la viabilidad de las células y se realiza con pinzas (a menudo también llamadas ranas). Una tercera técnica utilizada es el uso de perlas de vidrio estériles para sembrar células. En esta técnica, las células se cultivan en un cultivo líquido del cual se pipetea un pequeño volumen en la placa de agar y luego se extiende con las perlas. El cultivo de réplicas es otra técnica para sembrar células en placas de agar. Estas cuatro técnicas son las más comunes, pero también son posibles otras. Es fundamental trabajar de forma estéril para evitar la contaminación de las placas de agar. [1] Por lo tanto, el revestimiento se realiza a menudo en una cabina de flujo laminar o en la mesa de trabajo junto a un mechero Bunsen . [2]
Historia
En 1881, Fanny Hesse , que trabajaba como técnica para su marido Walther Hesse en el laboratorio de Robert Koch , sugirió el agar como agente endurecedor eficaz, ya que desde hacía tiempo era habitual en la elaboración de mermeladas. [3]
Tipos
Una placa de agar observada en un contador de colonias electrónico.Ejemplo de un algoritmo de análisis de posible infección bacteriana en casos sin objetivos específicamente solicitados (no bacterias, micobacterias, etc.), con las situaciones y agentes más comunes observados en un hospital comunitario de Nueva Inglaterra. Se utilizan diferentes placas de agar para diferentes fuentes de muestras, como se ve en el cuadrante superior izquierdo.
Al igual que otros medios de crecimiento , las formulaciones de agar utilizadas en placas pueden clasificarse como "definidas" o "indefinidas"; un medio definido se sintetiza a partir de sustancias químicas individuales requeridas por el organismo, por lo que se conoce la composición molecular exacta, mientras que un medio indefinido se elabora a partir de productos naturales como el extracto de levadura , donde se desconoce la composición precisa. [4]
Las placas de agar pueden formularse como permisivas, con la intención de permitir el crecimiento de cualquier organismo presente, o restrictivas o selectivas, con la intención de permitir únicamente el crecimiento de un subconjunto particular de esos organismos. [5] Esto puede tomar la forma de un requerimiento nutricional, por ejemplo proporcionando un compuesto particular como la lactosa como única fuente de carbono y seleccionando así sólo organismos que puedan metabolizar ese compuesto, o incluyendo un antibiótico particular u otra sustancia para seleccionar sólo organismos que sean resistentes a esa sustancia. Esto se correlaciona hasta cierto punto con los medios definidos e indefinidos; Los medios no definidos, elaborados a partir de productos naturales y que contienen una combinación desconocida de muchas moléculas orgánicas, suelen ser más permisivos en términos de satisfacer las necesidades de una variedad más amplia de organismos, mientras que los medios definidos pueden adaptarse con precisión para seleccionar organismos con propiedades específicas.
Las placas de agar también pueden ser placas indicadoras, en las que los organismos no se seleccionan en función del crecimiento, sino que se distinguen por un cambio de color en algunas colonias, generalmente causado por la acción de una enzima sobre algún compuesto agregado al medio. [6]
Las placas se incuban durante 12 horas hasta varios días dependiendo de la prueba que se realice.
Los tipos de placas de agar más utilizados incluyen:
Las placas de agar sangre (BAP) contienen sangre de mamíferos (generalmente de oveja o de caballo), normalmente en una concentración del 5 al 10%. Los BAP son medios diferenciales enriquecidos que se utilizan para aislar organismos exigentes y detectar actividad hemolítica . La actividad β-hemolítica mostrará lisis y digestión completa del contenido de glóbulos rojos que rodean una colonia. Los ejemplos incluyen Streptococcus haemolyticus . La α-hemólisis sólo provocará la lisis parcial de los glóbulos rojos (la membrana celular queda intacta) y aparecerá de color verde o marrón, debido a la conversión de hemoglobina en metahemoglobina. Un ejemplo de ello sería el Streptococcus viridans . γ-Hemólisis (o no hemolítica) es el término que se refiere a la falta de actividad hemolítica. [7] Los BAP también contienen extracto de carne o extracto de levadura , triptona , cloruro de sodio y agar. [8]
agar chocolate
El agar chocolate es un tipo de placa de agar sangre en la que las células sanguíneas se han lisado calentándolas a 80 °C. Se utiliza para cultivar bacterias respiratorias exigentes, como Haemophilus influenzae . El agar chocolate recibe su nombre por su color y, en realidad, el plato no contiene chocolate .
Agar CLED : agar cisteína , lactosa y deficiente en electrolitos se utiliza para aislar y diferenciar bacterias del tracto urinario, ya que inhibe el enjambre de especies de Proteus y puede diferenciar entre fermentadores y no fermentadores de lactosa.
El medio Granada se utiliza para aislar y diferenciar Streptococcus del grupo B , Streptococcus agalactiae a partir de muestras clínicas. Crece en medio Granada como colonias rojas y la mayoría de las bacterias que lo acompañan se inhiben.
El agar MacConkey es un medio selectivo y diferencial que se utiliza para diferenciar entre bacterias gramnegativas al mismo tiempo que inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas . La adición de sales biliares y cristal violeta al agar inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias grampositivas, lo que hace que el agar MacConkey sea selectivo. Se añaden lactosa y rojo neutro para diferenciar los fermentadores de lactosa, que forman colonias rosadas, de los no fermentadores de lactosa que forman colonias claras. Un medio alternativo, el azul de metileno y eosina, tiene un propósito similar. [11]
El agar manitol sal también es un medio selectivo y diferencial. El manitol indica organismos que fermentan el manitol: la fermentación del manitol produce ácido láctico , bajando el pH y volviendo la placa amarilla. La sal es para seleccionar halófilos ; Los organismos que no pueden soportar un alto contenido de sal no pueden crecer bien.
El agar Mueller-Hinton contiene infusión de carne de res, peptona y almidón y se utiliza principalmente para pruebas de susceptibilidad a los antibióticos. Puede ser en forma de agar sangre.
El agar nutritivo se utiliza habitualmente para el crecimiento de organismos no exigentes y la observación de la producción de pigmentos. Es seguro usarlo en los laboratorios de ciencias escolares porque no cultiva selectivamente bacterias patógenas .
El agar Önöz permite un diagnóstico bacteriológico más rápido, ya que las colonias de Salmonella y Shigella pueden diferenciarse de forma clara y fiable de otras enterobacterias. Los rendimientos de Salmonella de las muestras de heces obtenidas, cuando se utiliza este medio, son superiores a los obtenidos con agar LEIFSON o agar Salmonella-Shigella .
El agar alcohol feniletílico selecciona especies de Staphylococcus al tiempo que inhibe los bacilos gramnegativos (p. ej., Escherichia coli , Shigella , Proteus , etc.).
El agar R2A , un medio no específico, imita el agua, por lo que se utiliza para el análisis del agua.
El agar de soja tríptico (tripticasa) (TSA) es un medio de uso general producido por digestión enzimática de harina de soja y caseína . Con frecuencia es el medio base de otros tipos de agar; por ejemplo, las placas de agar sangre se elaboran enriqueciendo placas de TSA con sangre. Las placas TSA favorecen el crecimiento de muchas bacterias semi fastidiosas, incluidas algunas especies de Brucella , Corynebacterium , Listeria , Neisseria y Vibrio .
El agar xilosa - lisina - desoxicolato se utiliza para el cultivo de muestras de heces y contiene dos indicadores. Está formulado para inhibir las bacterias Gram positivas, mientras se fomenta el crecimiento de los bacilos Gram negativos. Las colonias de fermentadores de lactosa aparecen de color amarillo. También se utiliza para cultivar posibles Salmonella que puedan estar presentes en una muestra de alimento. La mayoría de las colonias de Salmonella producen un centro negro.
El agar Sabouraud se utiliza para cultivar hongos y tiene un pH bajo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias; también contiene el antibiótico gentamicina para inhibir específicamente el crecimiento de bacterias Gram-negativas.
El agar de infusión de heno es específico para el cultivo de mohos mucilaginosos (que no son hongos).
Los agares cromogénicos pueden distinguir algunos tipos importantes de infección por hongos.
Vista inferior de una placa de agar Sabouraud con una colonia de Trichophyton rubrum var. rodhaini
CHROMAgar (un agar cromogénico ) con su presentación distintiva de algunos de los principales hongos patógenos.
Hongos ( ascomicetos ) que crecen en cultivos axénicos , cada uno de los cuales es un cultivo de un organismo seleccionado y está libre de todos los demás organismos, lo que permite el estudio del organismo cultivado de forma aislada.
El medio de esporulación es el medio que se utiliza cuando es necesario formar esporas. También se puede utilizar cuando se trabaja con hongos o bacterias dependiendo de si la cepa es capaz o no de formar esporas.
Megaplato
Una placa de Petri de 2' x 4' llena con 14 litros (litros) de medio de agar derivado de algas creadas por científicos de Harvard que se utilizó para ver cómo E. coli evolucionó para ser resistente a los antibióticos. La megaplaca también ayudó a estudiar conceptos más singulares de microbiología, como la evolución paralela, la selección de mutaciones, la interferencia colonial, etc. [13]
^ ab Madigan M, Martinko J, eds. (2005). Brock Biología de los microorganismos (11ª ed.). Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1.
^ Sanders, Erin R. (11 de mayo de 2012). "Técnicas de laboratorio aséptico: métodos de revestimiento". Revista de experimentos visualizados (63): e3064. doi :10.3791/3064. PMC 4846335 . PMID 22617405. Archivado desde el original el 14 de noviembre de 2017 . Consultado el 3 de mayo de 2018 .
^ "Historia de la placa de agar". Noticias de laboratorio . Archivado desde el original el 11 de febrero de 2010 . Consultado el 22 de febrero de 2010 .
^ Ryan KJ; Ray CG, eds. (2004). Microbiología médica Sherris (4ª ed.). McGraw-Hill. ISBN0-8385-8529-9.
^ "Placas indicadoras" . Consultado el 12 de julio de 2018 .
^ "Placas de agar sangre y protocolos de hemólisis". Archivado desde el original el 2 de febrero de 2012 . Consultado el 28 de octubre de 2014 .
^ "Agar sangre: composición, preparación, usos e imágenes", Microbiology Info.com
^ ab Fisher, Bruce; Harvey, Richard P.; Champe, Pamela C. (2007). Reseñas ilustradas de Lippincott: Microbiología (Serie de reseñas ilustradas de Lippincott) . Hagerstwon, MD: Lippincott Williams y Wilkins. ISBN978-0-7817-8215-9.
^ Molinero, JH (1972). Experimentos en genética molecular. Laboratorio Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, Nueva York.
^ Jung, Benjamín; Hoilat, Gilles J. (2022), "MacConkey Medium", StatPearls , Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, PMID 32491326 , consultado el 12 de diciembre de 2022
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