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Microscopía de súper resolución

La microscopía de superresolución es una serie de técnicas de microscopía óptica que permiten que este tipo de imágenes tengan resoluciones superiores a las impuestas por el límite de difracción , [1] [2] que se debe a la difracción de la luz. [3] Las técnicas de imágenes de súper resolución se basan en el campo cercano (microscopía de túnel de fotones [4] , así como aquellas que utilizan Pendry Superlens y microscopía óptica de barrido de campo cercano ) o en el campo lejano . Entre las técnicas que se basan en este último se encuentran aquellas que mejoran la resolución sólo modestamente (hasta aproximadamente un factor de dos) más allá del límite de difracción, como la microscopía confocal con orificio cerrado o asistida por métodos computacionales como la deconvolución [5] o el detector. basada en reasignación de píxeles (por ejemplo, microscopía de reescaneo, [6] reasignación de píxeles [7] ), el microscopio 4Pi y tecnologías de microscopía de iluminación estructurada como SIM [8] [9] y SMI .

Hay dos grupos principales de métodos para microscopía de súper resolución en el campo lejano que pueden mejorar la resolución en un factor mucho mayor: [10]

  1. Superresolución determinista: los emisores más utilizados en microscopía biológica, los fluoróforos , muestran una respuesta no lineal a la excitación, que puede aprovecharse para mejorar la resolución. Dichos métodos incluyen STED , GSD , RESOLFT y SSIM.
  2. Superresolución estocástica: la complejidad química de muchas fuentes de luz molecular les confiere un comportamiento temporal complejo, que puede utilizarse para hacer que varios fluoróforos cercanos emitan luz en momentos separados y, por tanto, puedan resolverse en el tiempo. Estos métodos incluyen imágenes de fluctuación óptica de súper resolución (SOFI) y todos los métodos de localización de una sola molécula (SMLM), como SPDM , SPDMphymod , PALM , FPALM, STORM y dSTORM.

El 8 de octubre de 2014, el Premio Nobel de Química fue concedido a Eric Betzig , WE Moerner y Stefan Hell por "el desarrollo de la microscopía de fluorescencia superresuelta ", que lleva " la microscopía óptica a la nanodimensión ". [11] [12] La comunidad de investigación biomédica está adoptando cada vez más las diferentes modalidades de microscopía de superresolución, y estas técnicas se están convirtiendo en herramientas indispensables para comprender la función biológica a nivel molecular. [13]

Historia

En 1978, se habían desarrollado las primeras ideas teóricas para romper el límite de Abbe , que requería el uso de un microscopio 4Pi como microscopio de fluorescencia confocal de barrido láser donde la luz se enfoca desde todos los lados hacia un foco común que se utiliza para escanear el objeto. mediante excitación "punto por punto" combinada con detección "punto por punto". [14] Sin embargo, la publicación de 1978 [15] había llegado a una conclusión física incorrecta (es decir, un punto de luz en forma de punto) y había pasado por alto por completo el aumento de la resolución axial como el beneficio real de agregar el otro lado del ángulo sólido. [dieciséis]

Parte de la siguiente información se recopiló (con autorización) de una revisión de técnicas de microscopía de subdifracción realizada en un blog de química. [17] [18]

En 1986, Okhonin patentó un microscopio óptico de súper resolución basado en emisión estimulada. [19]

Técnicas de superresolución

Microscopía de túnel de fotones (PTM)[20]

Mejora local / ANSOM / nanoantenas ópticas

Microscopía de mapeo aleatorio óptico de campo cercano (NORM)

La microscopía de mapeo aleatorio óptico de campo cercano (NORM) es un método de adquisición óptica de campo cercano mediante un microscopio de campo lejano mediante la observación del movimiento browniano de nanopartículas en un líquido de inmersión. [21] [22]

NORM utiliza el escaneo de la superficie del objeto mediante nanopartículas que se mueven estocásticamente. A través del microscopio, las nanopartículas parecen puntos redondos simétricos. El ancho del punto es equivalente a la función de dispersión del punto (~ 250 nm) y está definido por la resolución del microscopio. Las coordenadas laterales de una partícula determinada se pueden evaluar con una precisión mucho mayor que la resolución del microscopio. Al recopilar información de muchos fotogramas, se puede trazar la distribución de intensidad del campo cercano en todo el campo de visión del microscopio. En comparación con NSOM y ANSOM, este método no requiere ningún equipo especial para el posicionamiento de la punta y tiene un gran campo de visión y una profundidad de enfoque. Debido a la gran cantidad de "sensores" de escaneo, es posible lograr la adquisición de imágenes en un tiempo más corto.

4Pi

Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada . El valor típico de 500 a 700 nm se puede mejorar a 100 a 150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con 5 a 7 veces menos volumen que el de la microscopía confocal estándar .

La mejora en la resolución se logra mediante el uso de dos lentes objetivo opuestos, ambos enfocados en la misma ubicación geométrica. Además, se minimiza cuidadosamente la diferencia en la longitud del camino óptico a través de cada una de las dos lentes objetivas. De este modo, las moléculas que se encuentran en la zona focal común de ambos objetivos pueden iluminarse de forma coherente desde ambos lados y la luz reflejada o emitida puede recogerse de forma coherente, es decir, es posible una superposición coherente de la luz emitida sobre el detector. El ángulo sólido que se utiliza para la iluminación y la detección aumenta y se acerca al caso ideal, donde la muestra se ilumina y se detecta desde todos los lados simultáneamente. [23] [24]

Hasta ahora, la mejor calidad en un microscopio 4Pi se ha logrado en combinación con la microscopía STED en células fijas [25] y la microscopía RESOLFT con proteínas conmutables en células vivas. [26]

Microscopía de iluminación estructurada (SIM)

Comparación de la resolución obtenida mediante microscopía de barrido láser confocal (arriba) y microscopía de iluminación estructurada 3D (microscopía 3D-SIM, abajo). Se muestran detalles de una envoltura nuclear . Poros nucleares (anti-NPC) rojos, envoltura nuclear (anti- Lamin ) verde, cromatina ( tinción DAPI ) azul. Barra de escala: 1 μm.

La microscopía de iluminación estructurada (SIM) mejora la resolución espacial al recopilar información del espacio de frecuencia fuera de la región observable. Este proceso se realiza en el espacio recíproco: la transformada de Fourier (FT) de una imagen SI contiene información adicional superpuesta de diferentes áreas del espacio recíproco; con varios fotogramas donde la iluminación se desplaza en alguna fase , es posible separar y reconstruir computacionalmente la imagen FT, que tiene mucha más información de resolución. El FT inverso devuelve la imagen reconstruida a una imagen de súper resolución.

La microscopía SIM podría potencialmente reemplazar a la microscopía electrónica como herramienta para algunos diagnósticos médicos. Estos incluyen el diagnóstico de trastornos renales, [27] cáncer de riñón, [28] y enfermedades de la sangre. [29]

Aunque el término "microscopía de iluminación estructurada" fue acuñado por otros en años posteriores, Guerra (1995) publicó por primera vez resultados [30] en los que la luz modelada por una rejilla de paso de 50 nm iluminaba una segunda rejilla de paso de 50 nm, con las rejillas rotadas con entre sí por la cantidad angular necesaria para lograr la ampliación. Aunque la longitud de onda de iluminación era de 650 nm, la rejilla de 50 nm se resolvió fácilmente. Esto mostró una mejora de casi cinco veces con respecto al límite de resolución de Abbe de 232 nm, que debería haber sido el más pequeño obtenido para la apertura numérica y la longitud de onda utilizadas. En un mayor desarrollo de este trabajo, Guerra demostró que la topografía lateral súper resuelta se logra cambiando de fase el campo evanescente. Varias patentes estadounidenses [31] fueron otorgadas a Guerra individualmente o con colegas, y asignadas a Polaroid Corporation . Dyer Energy Systems, Calimetrics Inc. y Nanoptek Corp. obtuvieron licencias para esta tecnología para el uso de esta técnica de súper resolución en almacenamiento de datos ópticos y microscopía.

Iluminación espacialmente modulada (SMI)

SMI + TIRF de tejido ocular humano afectado por degeneración macular

Una implementación de iluminación estructurada se conoce como iluminación espacialmente modulada (SMI). Al igual que la iluminación estructurada estándar, la técnica SMI modifica la función de dispersión de puntos (PSF) de un microscopio de manera adecuada. Sin embargo, en este caso "la resolución óptica en sí no mejora"; [32] en cambio, se utiliza iluminación estructurada para maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes, para "permitir mediciones de tamaño en dimensiones moleculares de unas pocas decenas de nanómetros". [32]

El microscopio Vertico SMI logra una iluminación estructurada mediante el uso de uno o dos rayos láser de interferencia opuestos a lo largo del eje. Luego, el objeto que se está fotografiando se mueve en pasos de alta precisión a través del campo de ondas, o el propio campo de ondas se mueve con respecto al objeto mediante cambios de fase. Esto da como resultado un tamaño axial y una resolución de distancia mejorados. [32] [33] [34]

SMI se puede combinar con otras tecnologías de superresolución, por ejemplo con 3D LIMON o LSI- TIRF como un interferómetro de reflexión interna total con iluminación estructurada lateralmente (este último instrumento y técnica es esencialmente un microscopio de efecto túnel de fotones desfasados, que emplea una tecnología interna total). microscopio de luz de reflexión con campo evanescente desfasado (Guerra, 1996) [31] ). Esta técnica SMI permite adquirir imágenes ópticas de luz de distribuciones de autofluoróforos en secciones de tejido ocular humano con una resolución óptica nunca antes igualada. El uso de tres longitudes de onda de excitación diferentes (488, 568 y 647 nm) permite recopilar información espectral sobre la señal de autofluorescencia. Esto se ha utilizado para examinar el tejido del ojo humano afectado por la degeneración macular . [35]

Biosensor

La biodetección es crucial para comprender las actividades de los componentes celulares en la biología celular. Los sensores codificados genéticamente han transformado este campo y normalmente constan de dos partes: el dominio de detección, que detecta la actividad o interacciones celulares, y el dominio de notificación, que produce señales mensurables. Hay dos tipos principales de sensores: sensores basados ​​en FRET que utilizan dos fluoróforos para una cuantificación precisa pero con algunas limitaciones, y biosensores de un solo fluoróforo que son más pequeños, más rápidos y permiten experimentos multiplexados, pero que pueden tener dificultades para obtener valores absolutos y detectar saturación de respuesta. Se han utilizado varios métodos de microscopía, incluidas imágenes de fluctuación óptica de súper resolución, para cuantificar y monitorear las actividades biológicas en tiempo real. Los ejemplos incluyen detección de calcio, pH y voltaje. Greenwald et al. ofrecer una visión más completa de estas aplicaciones. [36]

Técnicas funcionales deterministas.

La microscopía de transiciones de fluorescencia óptica saturable reversible (RESOLFT) es una microscopía óptica con muy alta resolución que puede obtener imágenes de detalles en muestras que no se pueden obtener con microscopía convencional o confocal . Dentro de RESOLFT se generalizan los principios de la microscopía STED [37] [38] y la microscopía GSD . Además, existen técnicas con otros conceptos además de RESOLFT o SSIM. Por ejemplo, la microscopía de fluorescencia que utiliza la propiedad óptica de puerta AND del centro de vacantes de nitrógeno , [39] o la superresolución mediante emisión estimulada de radiación térmica (SETR), que utiliza las superlinealidades intrínsecas de la radiación del cuerpo negro y expande la Concepto de superresolución más allá de la microscopía. [40]

Agotamiento estimulado de emisiones (STED)

Mejora de la resolución entre la microscopía confocal tradicional y la microscopía STED.

La microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) utiliza dos pulsos láser, el pulso de excitación para excitar los fluoróforos a su estado fluorescente y el pulso STED para la desexcitación de los fluoróforos mediante emisión estimulada . [19] [41] [42] [43] [44] [45] En la práctica, primero se aplica el pulso de láser de excitación, tras lo cual pronto sigue un pulso STED (también se utiliza STED sin pulsos que utilizan láseres de onda continua). Además, el pulso STED se modifica de tal manera que presenta un punto de intensidad cero que coincide con el punto focal de excitación. Debido a la dependencia no lineal de la tasa de emisión estimulada de la intensidad del haz STED, todos los fluoróforos alrededor del punto de excitación focal estarán en su estado apagado (el estado fundamental de los fluoróforos). Al escanear este punto focal, se recupera la imagen. El ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de la función de dispersión puntual (PSF) del punto focal de excitación puede teóricamente comprimirse a un ancho arbitrario aumentando la intensidad del pulso STED, de acuerdo con la ecuación ( 1 ).

   ( 1 )
donde ∆r es la resolución lateral, ∆ es el FWHM del PSF limitado por difracción, I max es la intensidad máxima del láser STED y es la intensidad umbral necesaria para lograr el agotamiento de las emisiones saturadas.

La principal desventaja del STED, que ha impedido su uso generalizado, es que la maquinaria es complicada. Por un lado, la velocidad de adquisición de imágenes es relativamente lenta para campos de visión grandes debido a la necesidad de escanear la muestra para recuperar una imagen. Por otro lado, puede ser muy rápido para campos de visión más pequeños: se han mostrado grabaciones de hasta 80 fotogramas por segundo. [46] [47] Debido al gran valor de I s asociado con STED, existe la necesidad de un pulso de excitación de alta intensidad, que puede causar daños a la muestra.

Agotamiento del estado fundamental (GSD)

La microscopía de agotamiento del estado fundamental (microscopía GSD) utiliza el estado triplete de un fluoróforo como estado apagado y el estado singlete como estado encendido, mediante el cual se usa un láser de excitación para impulsar los fluoróforos en la periferia de la molécula en estado singlete hacia el estado triplete. Esto es muy parecido a STED, donde el estado inactivo es el estado fundamental de los fluoróforos, razón por la cual la ecuación ( 1 ) también se aplica en este caso. El valor es menor que en STED, lo que hace posible obtener imágenes de súper resolución con una intensidad láser mucho menor. Sin embargo, en comparación con STED, los fluoróforos utilizados en GSD son generalmente menos fotoestables; y la saturación del estado triplete puede ser más difícil de lograr. [48]

Microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM)

La microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM) explota la dependencia no lineal de la tasa de emisión de fluoróforos de la intensidad del láser de excitación. [49] Al aplicar un patrón de iluminación sinusoidal [50] con una intensidad máxima cercana a la necesaria para saturar los fluoróforos en su estado fluorescente, se recuperan franjas de Moiré. Las franjas contienen información espacial de alto orden que puede extraerse mediante técnicas computacionales. Una vez extraída la información, se recupera una imagen de superresolución.

SSIM requiere cambiar el patrón de iluminación varias veces, lo que limita efectivamente la resolución temporal de la técnica. Además, existe la necesidad de fluoróforos muy fotoestables, debido a las condiciones de saturación, que causan daños por radiación a la muestra y restringen las posibles aplicaciones para las que se puede utilizar SSIM.

Se muestran ejemplos de esta microscopía en la sección Microscopía de iluminación estructurada (SIM): imágenes de núcleos celulares y etapas mitóticas registradas con microscopía 3D-SIM.

Técnicas funcionales estocásticas.

Microscopía de localización

La microscopía de localización de molécula única (SMLM) resume todas las técnicas microscópicas que logran superresolución aislando emisores y ajustando sus imágenes con la función de dispersión de puntos (PSF). Normalmente, el ancho de la función de dispersión de puntos (~ 250 nm) limita la resolución. Sin embargo, dado un emisor aislado, se puede determinar su ubicación con una precisión sólo limitada por su intensidad según la ecuación ( 2 ). [51]

   ( 2 )
donde Δloc es la precisión de localización, Δ es el FWHM (ancho total a la mitad del máximo) del PSF y N es el número de fotones recolectados.

Este proceso de ajuste sólo se puede realizar de manera confiable para emisores aislados (ver Deconvolución ), y las muestras biológicas interesantes están tan densamente etiquetadas con emisores que el ajuste es imposible cuando todos los emisores están activos al mismo tiempo. Las técnicas SMLM resuelven este dilema activando sólo un escaso subconjunto de emisores al mismo tiempo, localizando estos pocos emisores con mucha precisión, desactivándolos y activando otro subconjunto.

Teniendo en cuenta la pixelación del fondo y de la cámara, y utilizando la aproximación gaussiana para la función de dispersión de puntos ( disco Airy ) de un microscopio típico, la resolución teórica la propone Thompson et al. [52] y perfeccionado por Mortensen et al.: [53]

dónde
* σ es la desviación estándar gaussiana de las ubicaciones centrales de la misma molécula si se mide varias veces (por ejemplo, fotogramas de un vídeo). (unidad m)
* σ PSF es la desviación estándar gaussiana de la función de dispersión puntual, cuyo FWHM siguiendo la ecuación de Ernst Abbe d = λ/(2 NA) . (unidad m)
* a es el tamaño de cada píxel de la imagen. (unidad m)
* N sig son los recuentos de fotones del PSF total en todos los píxeles de interés. (sin unidades)
* N bg el recuento promedio de fotones de fondo por píxel (los recuentos oscuros ya se eliminaron), que se aproxima al cuadrado de la desviación estándar gaussiana del ruido de fondo de la distribución de Poisson de cada píxel a lo largo del tiempo o la desviación estándar de todos los píxeles con ruido de fondo únicamente. , σ bg 2 . Cuanto mayor sea σ bg 2 , mejor será la aproximación (por ejemplo, buena para σ bg 2 >10, excelente para σ bg 2 >1000). (sin unidades)
* La resolución FWHM es ~2,355 veces la desviación estándar gaussiana .

Generalmente, la microscopía de localización se realiza con fluoróforos. Los fluoróforos adecuados (por ejemplo, para STORM) residen en un estado oscuro no fluorescente durante la mayor parte del tiempo y se activan estocásticamente, normalmente con un láser de excitación de baja intensidad. Un láser de lectura estimula la fluorescencia y blanquea o fotoconmuta los fluoróforos de nuevo a un estado oscuro, normalmente en un plazo de 10 a 100 ms. En la acumulación de puntos para obtener imágenes en topografía a nanoescala (PAINT), los fluoróforos no son fluorescentes antes de unirse y son fluorescentes después. Los fotones emitidos durante la fase fluorescente se recogen con una cámara y la imagen resultante del fluoróforo (que es distorsionada por el PSF) se puede ajustar con una precisión muy alta, incluso del orden de unos pocos Angstroms. [54] Repetir el proceso varios miles de veces garantiza que todos los fluoróforos puedan pasar por el estado brillante y se registren. Luego, una computadora reconstruye una imagen súper resuelta.

Las características deseables de los fluoróforos utilizados para estos métodos, con el fin de maximizar la resolución, son que deben ser brillantes. Es decir, deberían tener un alto coeficiente de extinción y un alto rendimiento cuántico . También deben poseer una alta relación de contraste (relación entre el número de fotones emitidos en el estado de luz y el número de fotones emitidos en el estado de oscuridad). Además, es deseable una muestra densamente etiquetada, según los criterios de Nyquist .

La multitud de métodos de microscopía de localización difieren principalmente en el tipo de fluoróforos utilizados.

Microscopía de distancia de precisión espectral (SPDM)

Microscopía de súper resolución de molécula única de YFP / SPDMphymod

Se puede localizar una única y diminuta fuente de luz mucho mejor de lo que normalmente permite la resolución de un microscopio: aunque la luz producirá un punto borroso, se pueden utilizar algoritmos informáticos para calcular con precisión el centro del punto borroso, teniendo en cuenta la función de dispersión de puntos del microscopio, las propiedades de ruido del detector, etc. Sin embargo, este enfoque no funciona cuando hay demasiadas fuentes cercanas entre sí: todas las fuentes se vuelven borrosas.

La microscopía de distancia de precisión espectral (SPDM) es una familia de técnicas de localización en microscopía de fluorescencia que soluciona el problema de que haya muchas fuentes midiendo sólo unas pocas fuentes a la vez, de modo que cada fuente esté "ópticamente aislada" de las demás (es decir, , separados por una resolución superior a la del microscopio, normalmente ~200-250 nm), [55] [56] [57] si las partículas examinadas tienen diferentes firmas espectrales, de modo que sea posible observar la luz de unas pocas moléculas a la vez utilizando las fuentes de luz y filtros adecuados. De este modo se consigue una resolución óptica efectiva varias veces mejor que la resolución óptica convencional, que está representada por la mitad del ancho del máximo principal de la función de imagen puntual efectiva. [55]

La resolución estructural alcanzable utilizando SPDM se puede expresar en términos de la distancia más pequeña medible entre dos partículas puntiformes de diferentes características espectrales ("resolución topológica"). Los modelos han demostrado que, en condiciones adecuadas de precisión de localización, densidad de partículas, etc., la "resolución topológica" corresponde a una " frecuencia espacial " que, según la definición clásica, equivale a una resolución óptica muy mejorada. Las moléculas también se pueden distinguir de formas aún más sutiles basándose en la vida útil de la fluorescencia y otras técnicas. [55]

Una aplicación importante es la investigación del genoma (estudio de la organización funcional del genoma ). Otro campo de aplicación importante es la investigación de la estructura de las membranas.

SPDMphymod
Microscopía de localización de color dual SPDMphymod/microscopía de superresolución con proteínas de fusión GFP y RFP

La microscopía de localización para muchos tintes fluorescentes estándar como GFP , tintes Alexa y moléculas de fluoresceína es posible si están presentes ciertas condiciones fotofísicas. Con esta tecnología denominada fluoróforos físicamente modificables (SPDMphymod) , una sola longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la nanoimagen [58] en contraste con otras tecnologías de microscopía de localización que necesitan dos longitudes de onda láser cuando se utilizan moléculas de fluorescencia especiales fotoconmutables/fotoactivables. son usados. Otro ejemplo del uso de SPDMphymod es el análisis de partículas del virus del mosaico del tabaco (TMV) [59] o el estudio de la interacción virus-célula . [60] [61]

Basado en las transiciones de estado singlete-triplete, es crucial para SPDMphymod que este proceso esté en curso y conduzca al efecto de que una sola molécula llegue primero a un estado oscuro reversible de muy larga vida (con una vida media de hasta varios segundos) de que regresa a un estado fluorescente emitiendo muchos fotones durante varios milisegundos antes de regresar a un estado oscuro irreversible, de muy larga vida. La microscopía SPDMphymod utiliza moléculas fluorescentes que emiten la misma frecuencia de luz espectral pero con diferentes firmas espectrales según las características del parpadeo. Combinando dos mil imágenes de la misma célula, es posible, utilizando mediciones de precisión óptica láser, registrar imágenes de localización con una resolución óptica significativamente mejorada. [62]

Los tintes fluorescentes estándar que ya se utilizan con éxito con la tecnología SPDMphymod son GFP , RFP , YFP , Alexa 488 , Alexa 568, Alexa 647, Cy2 , Cy3, Atto 488 y fluoresceína .

Localización óptica criogénica en 3D (COLD)

La localización óptica criogénica en tres dimensiones (COLD) permite determinar los cuatro sitios de unión de biotina en la proteína estreptavidina.

La localización óptica criogénica en 3D (COLD) es un método que permite localizar múltiples sitios fluorescentes dentro de una única biomolécula de tamaño pequeño a mediano con resolución de escala Angstrom. [54] La precisión de la localización en este enfoque mejora porque la fotoquímica más lenta a bajas temperaturas conduce a una mayor cantidad de fotones que pueden emitirse desde cada fluoróforo antes del fotoblanqueo. [63] [64] Como resultado, la microscopía criogénica de localización estocástica logra la resolución submolecular requerida para resolver las posiciones 3D de varios fluoróforos unidos a una pequeña proteína. Empleando algoritmos conocidos por microscopía electrónica, las proyecciones 2D de los fluoróforos se reconstruyen en una configuración 3D. COLD lleva la microscopía de fluorescencia a su límite fundamental, dependiendo del tamaño de la etiqueta. El método también se puede combinar con otras técnicas de biología estructural, como cristalografía de rayos X, espectroscopia de resonancia magnética y microscopía electrónica, para proporcionar especificidad e información complementaria valiosa.

Microscopía de localización activada por unión (BALM)

fBALM Microscopía de localización de molécula única de superresolución utilizando microscopía de localización activada por unión asistida por fluctuación de la estructura del ADN

La microscopía de localización activada por unión (BALM) es un concepto general de microscopía de localización de molécula única (SMLM): imágenes súper resueltas de tintes de unión al ADN basadas en la modificación de las propiedades del ADN y un tinte. [65] Mediante un ajuste cuidadoso del entorno químico, que conduce a la fusión local y reversible del ADN y al control de la hibridación sobre la señal de fluorescencia, se pueden introducir moléculas de tinte de unión al ADN. Los tintes de ADN intercalados y de unión a surcos menores se pueden utilizar para registrar y aislar ópticamente sólo unas pocas señales de tinte de unión a ADN a la vez. El BALM asistido por fluctuación de la estructura del ADN (fBALM) se ha utilizado para diferencias a nanoescala en la arquitectura nuclear, con una resolución estructural anticipada de aproximadamente 50 nm. Imágenes de nanoestructura de cromatina con microscopía de localización activada por unión basada en fluctuaciones de la estructura del ADN. [66] Recientemente, la mejora significativa del rendimiento cuántico de fluorescencia de NIAD-4 al unirse a un amiloide se aprovechó para obtener imágenes BALM de fibrillas de amiloide [67] y oligómeros. [68]

TORMENTA, PALMA y FPALM

La microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) son técnicas de imágenes de súper resolución que utilizan activación secuencial y localización resuelta en el tiempo de fluoróforos fotoconmutables para crear imágenes de alta resolución. Durante la obtención de imágenes, solo un subconjunto de fluoróforos ópticamente resolubles se activa a un estado fluorescente en un momento dado, de modo que la posición de cada fluoróforo se puede determinar con alta precisión al encontrar las posiciones de los centroides de las imágenes de una sola molécula de un fluoróforo en particular. Posteriormente se desactiva un subconjunto de fluoróforos y se activa y se obtienen imágenes de otro subconjunto. La iteración de este proceso permite localizar numerosos fluoróforos y construir una imagen de súper resolución a partir de los datos de la imagen.

Estos tres métodos se publicaron de forma independiente durante un corto período de tiempo y sus principios son idénticos. STORM se describió originalmente usando colorantes Cy5 y Cy3 unidos a ácidos nucleicos o proteínas, [69] mientras que PALM y FPALM se describieron usando proteínas fluorescentes fotoconmutables. [70] [71] En principio, se puede utilizar cualquier fluoróforo fotoconmutable, y STORM se ha demostrado con una variedad de sondas y estrategias de etiquetado diferentes. Utilizando la fotoconmutación estocástica de fluoróforos individuales, como Cy5, [72] STORM se puede realizar con una única fuente de excitación láser roja. El láser rojo cambia el fluoróforo Cy5 a un estado oscuro mediante la formación de un aducto [73] [74] y posteriormente devuelve la molécula al estado fluorescente. También se han utilizado muchos otros tintes con STORM. [75] [76] [77] [78] [79] [80]

Además de los fluoróforos individuales, con STORM se pueden usar pares de tintes que consisten en un fluoróforo activador (como Alexa 405, Cy2 o Cy3) y un tinte indicador fotoconmutable (como Cy5, Alexa 647, Cy5.5 o Cy7). . [69] [81] [82] En este esquema, el fluoróforo activador, cuando se excita cerca de su máximo de absorción, sirve para reactivar el tinte fotoconmutable al estado fluorescente. Se han realizado imágenes multicolores utilizando diferentes longitudes de onda de activación para distinguir pares de tintes, dependiendo del fluoróforo activador utilizado, [81] [82] [83] o utilizando fluoróforos fotoconmutables espectralmente distintos, con o sin fluoróforos activadores. [75] [84] [85] También se pueden utilizar proteínas fluorescentes fotoconmutables. [70] [71] [85] [86] Se ha logrado un etiquetado altamente específico de estructuras biológicas con sondas fotoconmutables mediante tinción de anticuerpos, [81] [82] [83] [87] conjugación directa de proteínas, [88] y genética. codificación. [70] [71] [85] [86]

STORM también se ha extendido a imágenes tridimensionales utilizando astigmatismo óptico, en el que la forma elíptica de la función de dispersión de puntos codifica las posiciones x, y y z para muestras de hasta varios micrómetros de espesor, [82] [87] y ha sido demostrado en células vivas. [85] Hasta la fecha, la resolución espacial lograda por esta técnica es de ~20 nm en las dimensiones laterales y ~50 nm en la dimensión axial; y la resolución temporal es de entre 0,1 y 0,33 s. [ cita necesaria ]

Acumulación de puntos para imágenes en topografía a nanoescala (PAINT)

La acumulación de puntos para obtener imágenes en topografía a nanoescala (PAINT) es un método de localización de una sola molécula que logra una fluorescencia estocástica de una sola molécula mediante adsorción/absorción molecular y fotoblanqueo/desorción. [89] [90] El primer tinte utilizado fue el rojo Nilo , que no es fluorescente en solución acuosa pero sí fluorescente cuando se inserta en un entorno hidrofóbico, como micelas o paredes celulares vivas. Por tanto, la concentración del colorante se mantiene pequeña, a nivel nanomolar, de modo que la tasa de sorción de la molécula en el área limitada por difracción esté en la región de milisegundos. La unión estocástica de moléculas de un solo tinte (sondas) a un objetivo inmovilizado se puede resolver espacial y temporalmente bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio típico. Cada tinte se fotoblanquea para devolver el campo a un estado oscuro, de modo que el siguiente tinte pueda unirse y observarse. La ventaja de este método, en comparación con otros métodos estocásticos, es que además de obtener la imagen superresuelta del objetivo fijo, puede medir la cinética de unión dinámica de las moléculas sonda en difusión, en solución, al objetivo. [91] [90]

Combinando la técnica de superresolución 3D (por ejemplo, la función de dispersión de puntos de doble hélice desarrollada en el grupo de Moerner), tintes fotoactivados, intermitencia activa dependiente de la energía y acumulación de puntos para obtener imágenes en topografía a nanoescala, SPRAIPAINT (SPRAI=Super resolución por PoweR- La intermitencia activa dependiente [92] ) puede superar la resolución de las paredes de las células vivas. [93] PAINT funciona manteniendo un equilibrio entre las tasas de adsorción/absorción del tinte y las tasas de fotoblanqueo/desorción. Este saldo puede estimarse con principios estadísticos. [94] La tasa de adsorción o absorción de un soluto diluido a una superficie o interfaz en una solución gaseosa o líquida se puede calcular utilizando las leyes de difusión de Fick . La tasa de fotoblanqueo/desorción se puede medir para una determinada condición de solución y densidad de potencia de iluminación.

DNA-PAINT se ha ampliado aún más para utilizar tintes regulares, donde la unión y desunión dinámica de una sonda de ADN marcada con tinte a un origami de ADN fijo se utiliza para lograr imágenes estocásticas de una sola molécula. [95] [96] DNA-PAINT ya no se limita a tintes sensibles al medio ambiente y puede medir tanto la cinética de adsorción como la desorción de las sondas al objetivo. El método utiliza el efecto de desenfoque de la cámara de tintes en movimiento. Cuando un tinte normal se difunde en la solución, su imagen en una cámara CCD típica se ve borrosa debido a su velocidad relativamente rápida y al tiempo de exposición relativamente largo de la cámara, lo que contribuye al fondo de fluorescencia. Sin embargo, cuando se une a un objetivo fijo, el tinte deja de moverse; y se puede lograr una entrada clara en la función de dispersión de puntos.

El término para este método es mbPAINT ("mb" significa desenfoque de movimiento ). [97] Cuando se utiliza un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para obtener imágenes, la profundidad de excitación se limita a ~100 nm desde el sustrato, lo que reduce aún más el fondo de fluorescencia de los tintes borrosos cerca del sustrato y el fondo en masa. solución. Se pueden usar tintes muy brillantes para mbPAINT, que proporciona resoluciones espaciales típicas de fotograma único de ~20 nm y resoluciones temporales cinéticas de una sola molécula de ~20 ms bajo intensidades de fotoexcitación relativamente suaves, lo cual es útil para estudiar la separación molecular de proteínas individuales. [98]

La resolución temporal se ha mejorado aún más (20 veces) utilizando una máscara de fase rotacional colocada en el plano de Fourier durante la adquisición de datos y resolviendo la función de dispersión de puntos distorsionada que contiene información temporal. El método se denominó Microscopía de resolución súper temporal (STReM). [99]

Microscopía de localización sin etiquetas

Microscopía de localización sin etiquetas SPDM: la microscopía de súper resolución revela estructuras intracelulares previas indetectables

Se puede lograr una resolución óptica de estructuras celulares en el rango de aproximadamente 50 nm, incluso en células sin etiquetas, utilizando microscopía de localización SPDM .

Al utilizar dos longitudes de onda láser diferentes, SPDM revela objetos celulares que no son detectables en condiciones de imágenes de fluorescencia de campo amplio convencionales, además de lograr una mejora sustancial de la resolución de las estructuras autofluorescentes.

Como control, las posiciones de los objetos detectados en la imagen de localización coinciden con las de la imagen de campo claro. [100]

También se ha demostrado la microscopía de superresolución sin etiquetas utilizando las fluctuaciones de una señal de dispersión Raman mejorada en la superficie en una metasuperficie plasmónica altamente uniforme. [101]

Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)

dSTORM utiliza la fotoconmutación de un solo fluoróforo. En dSTORM, los fluoróforos están incrustados en un sistema tampón reductor y oxidante (ROXS) y se excita la fluorescencia. A veces, estocásticamente, el fluoróforo entrará en un triplete o en algún otro estado oscuro que sea sensible al estado de oxidación del tampón, a partir del cual se puede hacer que emitan fluorescencia, de modo que se puedan registrar las posiciones de las moléculas individuales. [102] El desarrollo del método dSTORM se produjo en 3 laboratorios independientes aproximadamente al mismo tiempo y también se denominó "microscopía de fotoblanqueo reversible" (RPM), [103] "microscopía de agotamiento del estado fundamental seguida de retorno de molécula individual" (GSDIM), [ 104] así como el ahora generalmente aceptado apodo dSTORM. [105]

Software para microscopía de localización.

La microscopía de localización depende en gran medida de un software que puede ajustar con precisión la función de dispersión puntual (PSF) a millones de imágenes de fluoróforos activos en unos pocos minutos. [106] Dado que los métodos de análisis clásicos y los paquetes de software utilizados en las ciencias naturales son demasiado lentos para resolver computacionalmente estos problemas, y a menudo requieren horas de cálculo para procesar datos medidos en minutos, se han desarrollado programas de software especializados. Muchos de estos paquetes de software de localización son de código abierto; están listados en SMLM Software Benchmark. [107] Una vez que se han determinado las posiciones de las moléculas, es necesario mostrar las ubicaciones y se han desarrollado varios algoritmos para la visualización. [108]

Imágenes de fluctuación óptica de súper resolución (SOFI)

Es posible evitar la necesidad de ajuste de PSF inherente a la microscopía de localización de molécula única (SMLM) calculando directamente la autocorrelación temporal de los píxeles. Esta técnica se llama imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) y se ha demostrado que es más precisa que SMLM cuando la densidad de fluoróforos simultáneamente activos es muy alta.

Microscopía de localización omnipresente (OLM)

La microscopía de localización omnipresente (OLM) es una extensión de las técnicas de microscopía de molécula única (SMLM) que permiten obtener imágenes de una sola molécula de alta densidad con una fuente de luz incoherente (como una lámpara de arco de mercurio) y una configuración de microscopio de epifluorescencia convencional. [109] Una breve ráfaga de excitación de color azul intenso (con un láser de 350-380 nm, en lugar de 405 nm) permite una reactivación prolongada de las moléculas, para una resolución de 90 nm en las muestras de prueba. Finalmente, se pueden realizar imágenes STED y SMLM correlativas en la misma muestra biológica utilizando un medio de imágenes simple, que puede proporcionar una base para una resolución mejorada adicional. Estos hallazgos pueden democratizar las imágenes de superresolución y ayudar a cualquier científico a generar imágenes de una sola molécula de alta densidad incluso con un presupuesto limitado.

Mejora de la resolución mediante imágenes secuenciales (RESI)

La mejora de la resolución mediante imágenes secuenciales (RESI) es una extensión de DNA-PAINT que puede lograr una resolución teóricamente ilimitada. [110] En lugar de utilizar un tipo de etiqueta para identificar una especie objetivo determinada, las copias del mismo objetivo se marcan con secuencias de ADN ortogonales. Mediante imágenes secuenciales (es decir, separadas), las nubes de localización que se superpondrían en SMLM convencional pueden (1) resolverse y (2) combinarse en una única "súper"localización, cuya precisión aumenta con el número subyacente de localizaciones. Como el número de localizaciones alcanzables en DNA-PAINT es ilimitado, también lo es la resolución teórica de RESI. La superposición de las localizaciones RESI de las rondas de imágenes subyacentes crea una imagen compuesta y de alta resolución.

Combinación de técnicas

Microscopía de nanodimensionamiento microscópico de luz 3D (LIMON)

Microscopía 3D de súper resolución de color dual con Her2 y Her3 en células mamarias, tintes estándar: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

Las imágenes de microscopía de nanotamaño microscópica óptica (3D LIMON), utilizando el microscopio Vertico SMI , son posibles gracias a la combinación de SMI y SPDM, mediante la cual se aplica primero el proceso SMI y luego SPDM.

El proceso SMI determina el centro de las partículas y su dispersión en la dirección del eje del microscopio. Mientras que el centro de partículas/moléculas se puede determinar con una precisión de 1 a 2 nm, la dispersión alrededor de este punto se puede determinar hasta un diámetro axial de aproximadamente 30 a 40 nm.

Posteriormente, la posición lateral de la partícula/molécula individual se determina utilizando SPDM, logrando una precisión de unos pocos nanómetros. [111]

Como aplicación biológica en el modo de color dual 3D, se logró la disposición espacial de los grupos Her2/neu y Her3 . Las posiciones en las tres direcciones de los grupos de proteínas se pudieron determinar con una precisión de aproximadamente 25 nm. [112]

Microscopía óptica y electrónica correlativa integrada.

La combinación de un microscopio de superresolución con un microscopio electrónico permite visualizar información contextual, con el etiquetado proporcionado por marcadores de fluorescencia. Esto supera el problema del fondo negro que queda al investigador cuando utiliza sólo un microscopio óptico. En un sistema integrado, la muestra se mide con ambos microscopios simultáneamente. [113]

Mejora de técnicas mediante redes neuronales.

Recientemente, debido a los avances en la informática de inteligencia artificial, se han utilizado redes neuronales de aprendizaje profundo ( GAN ) para mejorar la superresolución de imágenes fotográficas de microscopio óptico, [114] de 40x a 100x, [115] de 20x con un microscopio óptico. a 1500x, comparable a un microscopio electrónico de barrido, a través de una lente neural, [116] y con tomografía por emisión de positrones y microscopía de fluorescencia. [117]

Ver también

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