Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada . Con él, el rango típico de resolución axial de 500–700 nm se puede mejorar a 100–150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con un volumen 5–7 veces menor que el de la microscopía confocal estándar . [1]
La mejora en la resolución se logra utilizando dos lentes objetivos opuestos, ambos enfocados a la misma ubicación geométrica. Además, la diferencia en la longitud del recorrido óptico a través de cada una de las dos lentes objetivo se alinea cuidadosamente para que sea mínima. Con este método, las moléculas que residen en el área focal común de ambos objetivos se pueden iluminar de manera coherente desde ambos lados y la luz reflejada o emitida también se puede recolectar de manera coherente, es decir, es posible la superposición coherente de la luz emitida en el detector. El ángulo sólido que se utiliza para la iluminación y la detección aumenta y se acerca a su máximo. En este caso, la muestra se ilumina y se detecta desde todos los lados simultáneamente.
En la figura se muestra el modo de funcionamiento de un microscopio 4Pi. La luz láser se divide mediante un divisor de haz y se dirige mediante espejos hacia las dos lentes objetivas opuestas. En el punto focal común se produce la superposición de ambos haces de luz enfocados. Las moléculas excitadas en esta posición emiten luz fluorescente, que es recogida por ambas lentes objetivas, combinada por el mismo divisor de haz y reflejada por un espejo dicroico hacia un detector. Allí, puede volver a producirse la superposición de ambas vías de luz emitidas.
En el caso ideal, cada lente objetivo puede captar luz desde un ángulo sólido de . Con dos lentes objetivos se puede captar luz desde todas las direcciones (ángulo sólido ). El nombre de este tipo de microscopía se deriva del ángulo sólido máximo posible para la excitación y la detección. En la práctica, solo se pueden lograr ángulos de apertura de aproximadamente 140° para una lente objetivo, lo que corresponde a .
El microscopio se puede utilizar de tres formas diferentes: en un microscopio 4Pi de tipo A, se utiliza la superposición coherente de la luz de excitación para generar la mayor resolución. La luz de emisión se detecta desde un solo lado o en una superposición incoherente desde ambos lados. En un microscopio 4Pi de tipo B, solo interfiere la luz de emisión. Cuando se utiliza en el modo de tipo C, se permite que interfieran tanto la luz de excitación como la de emisión, lo que produce el mayor aumento de resolución posible (~7 veces a lo largo del eje óptico en comparación con la microscopía confocal).
En un microscopio 4Pi real, la luz no se puede aplicar ni captar desde todas las direcciones por igual, lo que genera los llamados lóbulos laterales en la función de dispersión de puntos . Normalmente (pero no siempre) se utiliza la microscopía de excitación de dos fotones en un microscopio 4Pi en combinación con un orificio de emisión para reducir estos lóbulos laterales a un nivel tolerable.
En 1971, Christoph Cremer y Thomas Cremer propusieron la creación de un holograma perfecto , es decir, uno que lleva toda la información del campo de emisión de una fuente puntual en todas las direcciones, un llamado holograma. [2] [3] Sin embargo, la publicación de 1978 [4] había llegado a una conclusión física incorrecta (es decir, un punto de luz puntual) y había pasado por alto por completo el aumento de la resolución axial como el beneficio real de agregar el otro lado del ángulo sólido. [5] La primera descripción de un sistema practicable de microscopía 4Pi, es decir, la configuración con dos lentes opuestas que interfieren, fue inventada por Stefan Hell en 1991. [6] Lo demostró experimentalmente en 1994. [7]
En los años siguientes, el número de aplicaciones de este microscopio ha aumentado. Por ejemplo, la excitación paralela y la detección con 64 puntos en la muestra simultáneamente combinadas con la resolución espacial mejorada dieron como resultado el registro exitoso de la dinámica de las mitocondrias en células de levadura con un microscopio 4Pi en 2002. [8] El fabricante de microscopios Leica Microsystems lanzó una versión comercial en 2004 [9] que luego se discontinuó.
Hasta ahora, la mejor calidad en un microscopio 4Pi se alcanzaba en conjunción con técnicas de súper resolución como el principio de agotamiento de emisión estimulada (STED). [10] Utilizando un microscopio 4Pi con haces de excitación y desexcitación apropiados, fue posible crear un punto de tamaño uniforme de 50 nm, lo que corresponde a un volumen focal reducido en comparación con la microscopía confocal por un factor de 150-200 en células fijas. Con la combinación de microscopía 4Pi y microscopía RESOLFT con proteínas conmutables, ahora es posible tomar imágenes de células vivas con niveles bajos de luz con resoluciones isotrópicas por debajo de los 40 nm. [11]
