La microscopía de agotamiento del estado fundamental ( microscopía GSD ) es una implementación del concepto RESOLFT . El método fue propuesto en 1995 [1] y demostrado experimentalmente en 2007. [2] Es el segundo concepto para superar la barrera de difracción en microscopía óptica de campo lejano publicado por Stefan Hell . Utilizando centros de vacancia de nitrógeno en diamantes se logró una resolución de hasta 7,8 nm en 2009. [3] Esto está muy por debajo del límite de difracción (~200 nm).
En la microscopía GSD se utilizan marcadores fluorescentes. En una condición, el marcador puede ser excitado libremente desde el estado fundamental y regresa espontáneamente a través de la emisión de un fotón de fluorescencia. Sin embargo, si se aplica adicionalmente luz de la longitud de onda apropiada, el colorante puede ser excitado a un estado oscuro de larga duración, es decir, un estado en el que no se produce fluorescencia. Mientras la molécula esté en el estado oscuro de larga duración (por ejemplo, un estado triplete ), no puede ser excitada desde el estado fundamental. El cambio entre estos dos estados (brillante y oscuro) mediante la aplicación de luz cumple todas las condiciones previas para el concepto RESOLFT y la obtención de imágenes a escala de sublongitud de onda, y por lo tanto se pueden obtener imágenes con una resolución muy alta. Para una implementación exitosa, la microscopía GSD requiere fluoróforos especiales con alto rendimiento de tripletes [4] o la eliminación del oxígeno mediante el uso de varios medios de montaje como Mowiol o Vectashield [2] .
La implementación en un microscopio es muy similar a la microscopía de depleción por emisión estimulada , sin embargo, puede operar con una sola longitud de onda para la excitación y el depleción. Usando un punto focal en forma de anillo apropiado para la luz que cambia las moléculas al estado oscuro, la fluorescencia se puede extinguir en la parte exterior del punto focal. Por lo tanto, la fluorescencia solo sigue teniendo lugar en el centro del punto focal del microscopio y se aumenta la resolución espacial.