microscopía STED

Técnica en microscopía de fluorescencia.

La microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) proporciona mejoras de resolución significativas con respecto a las posibles con la microscopía confocal .

La microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas ( STED ) es una de las técnicas que componen la microscopía de superresolución . Crea imágenes de superresolución mediante la desactivación selectiva de fluoróforos , minimizando el área de iluminación en el punto focal y mejorando así la resolución alcanzable para un sistema determinado. ^[1] Fue desarrollado por Stefan W. Hell y Jan Wichmann en 1994, ^[2] y Hell y Thomas Klar lo demostraron experimentalmente por primera vez en 1999. ^[3] Hell recibió el Premio Nobel de Química en 2014 por su desarrollo. En 1986, VA Okhonin ^[4] (Instituto de Biofísica, Academia de Ciencias de la URSS, Rama Siberiana, Krasnoyarsk) patentó la idea STED. ^[5] Esta patente era desconocida para Hell y Wichmann en 1994.

La microscopía STED es uno de varios tipos de técnicas de microscopía de súper resolución que se han desarrollado recientemente para evitar el límite de difracción de la microscopía óptica y aumentar la resolución. STED es una técnica funcional determinista que explota la respuesta no lineal de los fluoróforos comúnmente utilizados para etiquetar muestras biológicas para lograr una mejora en la resolución, es decir, STED permite tomar imágenes con resoluciones por debajo del límite de difracción. Esto difiere de las técnicas funcionales estocásticas, como la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), ya que estos métodos utilizan modelos matemáticos para reconstruir un límite de subdifracción a partir de muchos conjuntos de imágenes limitadas por difracción.

Fondo

Fórmula de Ernst Abbe para el límite de difracción, grabada en piedra en un monumento de Jena .

Diagrama de Jablonski que muestra el corrimiento al rojo del fotón estimulado. Este corrimiento al rojo permite ignorar el fotón estimulado.

Diagrama del diseño de un dispositivo STED. El diseño de doble láser permite que la excitación y la emisión estimulada se utilicen juntas para STED.

En la microscopía tradicional, la resolución que se puede obtener está limitada por la difracción de la luz . Ernst Abbe desarrolló una ecuación para describir este límite. La ecuación es:

${\displaystyle \mathrm {D} ={\frac {\lambda }{2n\sin {\alpha }}}={\frac {\lambda }{\mathrm {2NA} }}}$

donde D es el límite de difracción, λ es la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica , o el índice de refracción del medio multiplicado por el seno del ángulo de incidencia. n describe el índice de refracción de la muestra, α mide el semiángulo sólido desde el cual un objetivo capta la luz, λ es la longitud de onda de la luz utilizada para excitar la muestra y NA es la apertura numérica. Para obtener alta resolución (es decir, valores d pequeños), las longitudes de onda cortas y los valores altos de NA (NA = n sinα) son óptimos. ^[6] Este límite de difracción es el estándar por el cual se miden todos los métodos de superresolución. Debido a que STED desactiva selectivamente la fluorescencia, puede lograr una resolución mejor que la microscopía confocal tradicional. La fluorescencia normal se produce excitando un electrón desde el estado fundamental a un estado electrónico excitado de un nivel de energía fundamental diferente (S0 pasa a S1) que, después de relajarse de nuevo al estado fundamental (de S1), emite un fotón al caer de S1 a un nivel de energía vibratoria en S0. STED interrumpe este proceso antes de que se libere el fotón. El electrón excitado se ve obligado a relajarse a un estado de vibración más alto del que entraría la transición de fluorescencia, lo que hace que el fotón liberado se desplace al rojo como se muestra en la imagen de la derecha. ^[7] Debido a que el electrón pasa a un estado de vibración más alto, la diferencia de energía de los dos estados es menor que la diferencia de fluorescencia normal. Esta disminución de energía aumenta la longitud de onda y hace que el fotón se desplace más hacia el extremo rojo del espectro. Este cambio diferencia los dos tipos de fotones y permite ignorar el fotón estimulado.

Para forzar que se produzca esta emisión alternativa, un fotón incidente debe chocar contra el fluoróforo. Esta necesidad de ser alcanzado por un fotón incidente tiene dos implicaciones para STED. En primer lugar, la cantidad de fotones incidentes afecta directamente la eficiencia de esta emisión y, en segundo lugar, con una cantidad suficientemente grande de fotones la fluorescencia se puede suprimir por completo. ^[8] Para lograr la gran cantidad de fotones incidentes necesarios para suprimir la fluorescencia, el láser utilizado para generar los fotones debe ser de alta intensidad. Desafortunadamente, este láser de alta intensidad puede provocar el problema del fotoblanqueo del fluoróforo. Fotoblanqueo es el nombre que se le da a la destrucción de fluoróforos mediante luz de alta intensidad.

Proceso

Comparación de microscopía confocal y microscopía STED. Esto muestra la resolución mejorada de la microscopía STED con respecto a las técnicas tradicionales.

Punto de excitación (2D, izquierda), punto de deexcitación en forma de rosquilla (centro) y área restante que permite la fluorescencia (derecha).

STED funciona agotando la fluorescencia en regiones específicas de la muestra mientras deja un punto focal central activo para emitir fluorescencia. Esta área focal se puede diseñar alterando las propiedades del plano pupilar de la lente objetivo. ^{[9] [10] [11]} El primer ejemplo más común de estos elementos ópticos difractivos, o DOE, es una forma de toro utilizada en confinamiento lateral bidimensional que se muestra a continuación. La zona roja se agota, mientras que la zona verde se deja activa. Este DOE se genera mediante una polarización circular del láser de agotamiento, combinada con un vórtice óptico . La resolución lateral de este DOE suele estar entre 30 y 80 nm. Sin embargo, se han informado valores de hasta 2,4 nm. ^[12] Utilizando diferentes DOE, se ha demostrado una resolución axial del orden de 100 nm. ^[13] Una ecuación de Abbe modificada describe esta resolución de subdifracción como:

${\displaystyle \mathrm {D} ={\frac {\lambda }{2n\sin {\alpha }{\sqrt {1+{\frac {I}{I_{\text{sat}}}}}}}}={\frac {\lambda }{\mathrm {2NA} {\sqrt {1+\sigma }}}}}$

Donde es el índice de refracción del medio, es la intensidad intracavitaria y es la intensidad de saturación . ¿Dónde está el factor de saturación que expresa la relación entre la intensidad STED aplicada (máxima) y la intensidad de saturación ? ^{[6] [14]} ${\textstyle n}$ ${\textstyle I}$ ${\textstyle I_{\text{sat}}}$ ${\textstyle \sigma }$ ${\textstyle \sigma =I_{\text{max}}/I_{\text{sat}}}$

Para optimizar la eficacia de STED, la interferencia destructiva en el centro del punto focal debe ser lo más perfecta posible. Esto impone ciertas limitaciones a la óptica que se puede utilizar.

Tintes

Al principio del desarrollo de STED, la cantidad de tintes que podían usarse en el proceso era muy limitada. La rodamina B fue nombrada en la primera descripción teórica de STED. ^[2] Como resultado, los primeros tintes utilizados fueron los que emitían láser en el espectro rojo. Para permitir el análisis STED de sistemas biológicos, los tintes y las fuentes láser deben adaptarse al sistema. Este deseo de un mejor análisis de estos sistemas ha llevado a STED de células vivas y STED multicolor, pero también ha exigido tintes y sistemas de excitación cada vez más avanzados para adaptarse a la mayor funcionalidad. ^[7]

Uno de esos avances fue el desarrollo de células inmunomarcadas. Estas células son tintes fluorescentes STED unidos a anticuerpos mediante enlaces amida. El primer uso de esta técnica combinó MR-121SE, un tinte rojo, con un anticuerpo secundario anti-ratón. ^[8] Desde esa primera aplicación, esta técnica se ha aplicado a una gama mucho más amplia de tintes, incluidos los de emisión verde, Atto 532, ^{[15] [16] [17]} y los de emisión amarilla, Atto 590, ^[18], así como otros Tintes emisores de color rojo. Además, Atto 647N se utilizó por primera vez con este método para producir STED de dos colores. ^[19]

Aplicaciones

En los últimos años, STED ha pasado de ser una técnica compleja y muy específica a convertirse en un método de fluorescencia general. Como resultado, se han desarrollado varios métodos para ampliar la utilidad de STED y permitir que se proporcione más información.

Análisis estructural

Desde el inicio del proceso, STED ha permitido que la microscopía de fluorescencia realice tareas que sólo eran posibles mediante microscopía electrónica. Como ejemplo, se utilizó STED para dilucidar el análisis de la estructura de proteínas a nivel de suborgánulos. La prueba común de este nivel de estudio es la observación de los filamentos del citoesqueleto. Además, los neurofilamentos , la actina y la tubulina se utilizan a menudo para comparar el poder de resolución de los microscopios STED y confocales. ^{[20] [21] [22]}

Utilizando STED, se logró una resolución lateral de 70 a 90 nm al examinar SNAP25 , una proteína humana que regula la fusión de membranas. Esta observación ha demostrado que SNAP25 forma grupos independientemente de la funcionalidad del motivo SNARE y se une a la sintaxina agrupada. ^{[23] [24]} Los estudios de orgánulos complejos, como las mitocondrias, también se benefician de la microscopía STED para el análisis estructural. Utilizando microscopios STED hechos a medida con una resolución lateral de menos de 50 nm, se descubrió que las proteínas mitocondriales Tom20 , VDAC1 y COX2 se distribuyen como grupos a nanoescala. ^{[25] [26]} Otro estudio utilizó una microscopía STED casera y un tinte fluorescente de unión al ADN , midió las longitudes de los fragmentos de ADN con mucha más precisión que la medición convencional con microscopía confocal . ^[27]

Métodos correlativos

Debido a su función, la microscopía STED a menudo se puede utilizar con otros métodos de alta resolución. La resolución de la microscopía electrónica y de fuerza atómica es incluso mejor que la resolución STED, pero al combinar la fuerza atómica con STED, Shima et al. Pudieron visualizar el citoesqueleto de actina de las células de cáncer de ovario humano mientras observaban cambios en la rigidez celular. ^[28]

Multicolor

STED multicolor se desarrolló en respuesta a un problema creciente en el uso de STED para estudiar la dependencia entre estructura y función en proteínas. Para estudiar este tipo de sistemas complejos, se deben utilizar al menos dos fluoróforos separados. Utilizando dos tintes fluorescentes y pares de haces, es posible obtener imágenes colocalizadas de grupos de proteínas sinápticas y mitocondriales con una resolución de hasta 5 nm [18]. STED multicolor también se ha utilizado para demostrar que diferentes poblaciones de proteínas de vesículas sinápticas no se mezclan con botones sinápticos de escape. ^{[29] [30]} Al utilizar STED de dos colores con imágenes de vida útil múltiple, es posible STED de tres canales.

célula viva

Al principio se pensó que STED era una técnica útil para trabajar con células vivas. ^[13] Desafortunadamente, la única forma de estudiar las células era etiquetar la membrana plasmática con tintes orgánicos. ^[29] La combinación de STED con espectroscopía de correlación de fluorescencia demostró que los complejos moleculares mediados por el colesterol atrapan los esfingolípidos , pero sólo de forma transitoria. ^[31] Sin embargo, sólo las proteínas fluorescentes proporcionan la capacidad de visualizar cualquier orgánulo o proteína en una célula viva. Se demostró que este método funciona con una resolución lateral de 50 nm dentro de células de mamíferos que expresan tubulina citrina. ^{[32] [33]} Además de detectar estructuras en células de mamíferos, STED ha permitido la visualización de proteínas PIN marcadas con YFP agrupadas en la membrana plasmática de células vegetales. ^[34]

Recientemente, se realizó STED multicolor de células vivas utilizando un láser rojo lejano pulsado y expresión de etiquetas CLIPf y SNAPf. ^[35]

En el cerebro de animales intactos.

Se pueden obtener imágenes repetitivas de las capas superficiales de la corteza del ratón a través de una ventana craneal. ^[36] Esto permite seguir el destino y la forma de las espinas dendríticas individuales durante muchas semanas. ^[37] Con STED de dos colores, es incluso posible resolver la nanoestructura de la densidad postsináptica en animales vivos. ^[38]

STED a precios de video y más

La superresolución requiere píxeles pequeños, lo que significa más espacios para adquirir en una muestra determinada, lo que lleva a un tiempo de adquisición más largo. Sin embargo, el tamaño del punto focal depende de la intensidad del láser que se utiliza para el agotamiento. Como resultado, este tamaño de punto se puede ajustar, cambiando el tamaño y la velocidad de la imagen. Luego se puede llegar a un compromiso entre estos dos factores para cada tarea de obtención de imágenes específica. Se han registrado velocidades de 80 fotogramas por segundo, con puntos focales de alrededor de 60 nm. ^{[1] [39]} Se pueden alcanzar hasta 200 fotogramas por segundo para campos de visión pequeños. ^[40]

Problemas

El fotoblanqueo puede ocurrir ya sea por excitación a un estado de excitación aún mayor o por excitación en el estado triplete. Para evitar la excitación de un electrón excitado a otro estado excitado superior, la energía del fotón necesaria para desencadenar la emisión alternativa no debe superponerse a la energía de excitación de un estado excitado a otro. ^[41] Esto asegurará que cada fotón láser que entre en contacto con los fluoróforos provocará una emisión estimulada y no provocará que el electrón se excite a otro estado de mayor energía. Los estados tripletes tienen una vida mucho más larga que los estados singletes y, para evitar que los estados tripletes se exciten, el tiempo entre los pulsos del láser debe ser lo suficientemente largo como para permitir que el electrón se relaje mediante otro método de extinción, o se debe agregar un compuesto químico para apagar el triplete. estado. ^{[20] [42] [43]}

Ver también

• Microscopia confocal
• Fluorescencia
• microscopio de fluorescencia
• Microscopía de agotamiento del estado fundamental.
• Microscopía confocal de barrido láser.
• Microscopio optico
• Microscopía de localización fotoactivada.
• Microscopía de reconstrucción óptica estocástica.
• Microscopía de súper resolución

Referencias

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enlaces externos

• Descripción general en el Departamento de NanoBiofotónica del Instituto Max Planck de Química Biofísica .
• Breve resumen de las ecuaciones RESOLFT desarrolladas por Stefan Hell .
• Conferencia de Stefan Hell: Superresolución: descripción general y microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED)
• Microscopía óptica: una revolución contemporánea en curso (revisión introductoria)