En bioquímica , el dinucleótido de flavina adenina ( FAD ) es una coenzima activa redox asociada con varias proteínas , que participa en varias reacciones enzimáticas en el metabolismo . Una flavoproteína es una proteína que contiene un grupo flavina , que puede estar en forma de FAD o mononucleótido de flavina (FMN). Se conocen muchas flavoproteínas: componentes del complejo succinato deshidrogenasa, α-cetoglutarato deshidrogenasa y un componente del complejo piruvato deshidrogenasa .
FAD puede existir en cuatro estados redox, que son el óxido de flavina-N(5) , quinona , semiquinona e hidroquinona . [1] FAD se convierte entre estos estados aceptando o donando electrones. El FAD, en su forma completamente oxidada, o forma de quinona , acepta dos electrones y dos protones para convertirse en FADH 2 (forma de hidroquinona). La semiquinona (FADH · ) puede formarse mediante reducción de FAD u oxidación de FADH 2 aceptando o donando un electrón y un protón, respectivamente. Algunas proteínas, sin embargo, generan y mantienen una forma superoxidada del cofactor de flavina, el óxido de flavina-N(5). [2] [3]
Las flavoproteínas se descubrieron por primera vez en 1879 separando los componentes de la leche de vaca. Inicialmente se les llamó lactocromos por su origen lechoso y su pigmento amarillo . [4] Fueron necesarios 50 años para que la comunidad científica lograra avances sustanciales en la identificación de las moléculas responsables del pigmento amarillo. La década de 1930 inició el campo de la investigación de las coenzimas con la publicación de muchas estructuras derivadas de flavina y nicotinamida y sus funciones obligadas en la catálisis redox. Los científicos alemanes Otto Warburg y Walter Christian descubrieron en 1932 una proteína amarilla derivada de la levadura necesaria para la respiración celular. Su colega Hugo Theorell separó esta enzima amarilla en apoenzima y pigmento amarillo, y demostró que ni la enzima ni el pigmento eran capaces de oxidar el NADH en su superficie. propios, pero mezclarlos restauraría la actividad. Theorell confirmó que el pigmento era el éster fosfato de riboflavina , el mononucleótido de flavina (FMN), en 1937, lo que fue la primera evidencia directa de cofactores enzimáticos . [5] Warburg y Christian luego descubrieron que FAD era un cofactor de la D-aminoácido oxidasa a través de experimentos similares en 1938. [6] El trabajo de Warburg sobre la vinculación de la nicotinamida a las transferencias de hidruros y el descubrimiento de las flavinas allanaron el camino para muchos científicos en los años 40. y 50 años para descubrir grandes cantidades de bioquímica redox y vincularlas en vías como el ciclo del ácido cítrico y la síntesis de ATP .
El dinucleótido de flavina y adenina consta de dos porciones: el nucleótido de adenina ( monofosfato de adenosina ) y el mononucleótido de flavina (FMN) unidos entre sí a través de sus grupos fosfato . La adenina está unida a una ribosa cíclica en el carbono 1' , mientras que el fosfato está unido a la ribosa en el carbono 5' para formar el nucleótido de adenina. La riboflavina se forma por un enlace carbono-nitrógeno (CN) entre la isoaloxazina y el ribitol . Luego, el grupo fosfato se une al carbono ribosa terminal, formando un FMN. Debido a que el enlace entre la isoaloxazina y el ribitol no se considera un enlace glicosídico , el mononucleótido de flavina no es verdaderamente un nucleótido. [7] Esto hace que el nombre del dinucleótido sea engañoso; sin embargo, el grupo mononucleótido de flavina todavía está muy cerca de un nucleótido en su estructura y propiedades químicas.
FAD se puede reducir a FADH 2 mediante la adición de 2 H + y 2 e - . FADH 2 también se puede oxidar mediante la pérdida de 1 H + y 1 e − para formar FADH. La forma FAD se puede recrear mediante la pérdida adicional de 1 H + y 1 e - . La formación de FAD también puede ocurrir mediante la reducción y deshidratación del óxido de flavina-N(5). [8] Según el estado de oxidación, las flavinas toman colores específicos cuando están en solución acuosa . El óxido de flavina N (5) (superoxidado) es de color amarillo anaranjado, el FAD (completamente oxidado) es amarillo, el FADH (semireducido) es azul o rojo según el pH y la forma completamente reducida es incolora. [9] [10] Cambiar la forma puede tener un gran impacto en otras propiedades químicas. Por ejemplo, FAD, la forma completamente oxidada está sujeta a ataque nucleofílico , la forma completamente reducida, FADH 2 , tiene una alta polarizabilidad , mientras que la forma medio reducida es inestable en solución acuosa. [11] FAD es un sistema de anillos aromáticos , mientras que FADH 2 no lo es. [12] Esto significa que FADH 2 tiene una energía significativamente mayor, sin la estabilización mediante resonancia que proporciona la estructura aromática. FADH 2 es una molécula portadora de energía, porque una vez oxidada recupera la aromaticidad y libera la energía representada por esta estabilización.
Las propiedades espectroscópicas de FAD y sus variantes permiten el seguimiento de la reacción mediante el uso de espectroscopías de fluorescencia y absorción UV-VIS . Cada forma de FAD tiene espectros de absorbancia distintos, lo que facilita la observación de los cambios en el estado de oxidación. [11] Un máximo de absorbancia local importante para FAD se observa a 450 nm, con un coeficiente de extinción de 11.300 M −1 cm −1 . [13] Las flavinas en general tienen actividad fluorescente cuando no están unidas (las proteínas unidas a derivados del ácido nucleico de flavina se llaman flavoproteínas ). Esta propiedad se puede utilizar al examinar la unión de proteínas, observando la pérdida de actividad fluorescente cuando se pone en estado unido. [11] Las flavinas oxidadas tienen altas absorbancias de aproximadamente 450 nm y fluorescen a aproximadamente 515-520 nm. [9]
En los sistemas biológicos, FAD actúa como aceptor de H + y e - en su forma completamente oxidada, aceptor o donante en la forma FADH y donante en la forma reducida de FADH 2 . El siguiente diagrama resume los posibles cambios que puede sufrir.
Además de lo visto anteriormente, se pueden formar y consumir otras formas reactivas de FAD. Estas reacciones implican la transferencia de electrones y la formación/rotura de enlaces químicos . A través de mecanismos de reacción , FAD puede contribuir a las actividades químicas dentro de los sistemas biológicos. Las siguientes imágenes muestran formas generales de algunas de las acciones en las que pueden participar los DCP.
Los mecanismos 1 y 2 representan la ganancia de hidruro , en la que la molécula gana lo que equivale a un ion hidruro. Mecanismos 3 y 4 de formación de radicales y pérdida de hidruros. Las especies radicales contienen átomos de electrones desapareados y son muy activas químicamente. La pérdida de hidruros es el proceso inverso de la ganancia de hidruros vista antes. Los dos últimos mecanismos muestran una adición nucleofílica y una reacción que utiliza un radical de carbono.
FAD desempeña un papel importante como cofactor enzimático junto con el mononucleótido de flavina , otra molécula procedente de la riboflavina. [8] Las bacterias, los hongos y las plantas pueden producir riboflavina , pero otros eucariotas , como los humanos, han perdido la capacidad de producirla. [9] Por lo tanto, los seres humanos deben obtener riboflavina, también conocida como vitamina B2, de fuentes dietéticas. [14] La riboflavina generalmente se ingiere en el intestino delgado y luego se transporta a las células a través de proteínas portadoras. [9] La riboflavina quinasa (EC 2.7.1.26) agrega un grupo fosfato a la riboflavina para producir mononucleótido de flavina, y luego la FAD sintetasa une un nucleótido de adenina ; ambos pasos requieren ATP . [9] Las bacterias generalmente tienen una enzima bifuncional, pero las arqueas y los eucariotas suelen emplear dos enzimas distintas. [9] Las investigaciones actuales indican que existen distintas isoformas en el citosol y las mitocondrias . [9] Parece que la planta se sintetiza en ambos lugares y potencialmente se transporta donde sea necesario. [11]
Las flavoproteínas utilizan la estructura única y versátil de los restos de flavina para catalizar reacciones redox difíciles. Dado que las flavinas tienen múltiples estados redox, pueden participar en procesos que implican la transferencia de uno o dos electrones, átomos de hidrógeno o iones hidronio . El N5 y el C4a del anillo de flavina completamente oxidado también son susceptibles al ataque nucleofílico . [15] Esta amplia variedad de ionización y modificación del resto de flavina se puede atribuir al sistema de anillos de isoaloxazina y a la capacidad de las flavoproteínas de perturbar drásticamente los parámetros cinéticos de las flavinas al unirse, incluido el dinucleótido de flavina adenina (FAD).
El número de genes codificados por proteínas dependientes de flavina en el genoma (el flavoproteoma) depende de la especie y puede variar entre 0,1% y 3,5%; los humanos tienen 90 genes codificados por flavoproteínas. [16] FAD es la forma más compleja y abundante de flavina y se informa que se une al 75% del flavoproteoma total [16] y al 84% de las flavoproteínas codificadas en humanos. [17] Se informaron concentraciones celulares de flavinas libres o unidas no covalentemente en una variedad de líneas celulares de mamíferos cultivadas para FAD (2,2-17,0 amol/célula) y FMN (0,46-3,4 amol/célula). [18]
FAD tiene un potencial de reducción más positivo que NAD+ y es un agente oxidante muy fuerte. La célula utiliza esto en muchas reacciones de oxidación energéticamente difíciles, como la deshidrogenación de un enlace CC a un alqueno . Las proteínas dependientes de FAD funcionan en una gran variedad de vías metabólicas que incluyen el transporte de electrones, la reparación del ADN, la biosíntesis de nucleótidos, la betaoxidación de ácidos grasos, el catabolismo de aminoácidos, así como la síntesis de otros cofactores como CoA , CoQ y grupos hemo . Una reacción bien conocida es parte del ciclo del ácido cítrico (también conocido como TCA o ciclo de Krebs); La succinato deshidrogenasa (complejo II en la cadena de transporte de electrones ) requiere FAD unido covalentemente para catalizar la oxidación del succinato a fumarato acoplándolo con la reducción de ubiquinona a ubiquinol . [11] Los electrones de alta energía de esta oxidación se almacenan momentáneamente al reducir FAD a FADH 2 . FADH 2 luego vuelve a FAD, enviando sus dos electrones de alta energía a través de la cadena de transporte de electrones; la energía en FADH 2 es suficiente para producir 1,5 equivalentes de ATP [19] mediante fosforilación oxidativa . Algunas flavoproteínas redox se unen de forma no covalente a FAD como las acetil-CoA-deshidrogenasas que participan en la beta-oxidación de ácidos grasos y el catabolismo de aminoácidos como la leucina ( isovaleril-CoA deshidrogenasa ), isoleucina (acil-CoA de cadena corta/ramificada). deshidrogenasa), valina (isobutiril-CoA deshidrogenasa) y lisina ( glutaril-CoA deshidrogenasa ). [20] Ejemplos adicionales de enzimas dependientes de FAD que regulan el metabolismo son la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (síntesis de triglicéridos) y la xantina oxidasa involucradas en el catabolismo de los nucleótidos de purina . [21] Las funciones no catalíticas que la FAD puede desempeñar en las flavoproteínas incluyen funciones estructurales, o involucradas en fotorreceptores de luz sensibles al azul que regulan los relojes biológicos y el desarrollo, y la generación de luz en bacterias bioluminiscentes . [20]
Las flavoproteínas tienen una molécula FMN o FAD como grupo protésico; este grupo protésico puede estar estrechamente unido o unido covalentemente. Sólo alrededor del 5-10% de las flavoproteínas tienen un FAD unido covalentemente, pero estas enzimas tienen un poder redox más fuerte. [11] En algunos casos, FAD puede proporcionar soporte estructural para sitios activos o proporcionar estabilización de intermediarios durante la catálisis. [20] Según los datos estructurales disponibles, los sitios de unión de DCP conocidos se pueden dividir en más de 200 tipos. [22]
En el genoma humano están codificadas 90 flavoproteínas; alrededor del 84% requiere FAD y alrededor del 16% requiere FMN, mientras que 5 proteínas requieren que ambas estén presentes. [17] Las flavoproteínas se encuentran principalmente en las mitocondrias debido a su poder redox. [17] De todas las flavoproteínas, el 90% realizan reacciones redox y el otro 10% son transferasas , liasas , isomerasas , ligasas . [dieciséis]
La monoaminooxidasa (MAO) es una flavoenzima ampliamente estudiada debido a su importancia biológica con el catabolismo de la noradrenalina , la serotonina y la dopamina . La MAO oxida aminas primarias, secundarias y terciarias, que se hidrolizan de forma no enzimática de imina a aldehído o cetona . Aunque esta clase de enzima ha sido ampliamente estudiada, su mecanismo de acción aún está en debate. Se han propuesto dos mecanismos: un mecanismo radical y un mecanismo nucleofílico. El mecanismo radical es menos aceptado generalmente porque no existe evidencia de resonancia paramagnética espectral o electrónica de la presencia de un radical intermedio. El mecanismo nucleofílico es más favorecido porque está respaldado por estudios de mutagénesis dirigida al sitio que mutaron dos residuos de tirosina que se esperaba que aumentaran la nucleofilicidad de los sustratos. [23]
La glucosa oxidasa (GOX) cataliza la oxidación de β-D-glucosa a D-glucono-δ-lactona con la reducción simultánea de flavina unida a enzima. GOX existe como un homodímero, y cada subunidad se une a una molécula de FAD. Las estructuras cristalinas muestran que FAD se une a una bolsa profunda de la enzima cerca de la interfaz del dímero. Los estudios demostraron que al reemplazar FAD con 8-hidroxi-5-carba-5-deaza FAD, la estereoquímica de la reacción se determinó al reaccionar con la cara de la flavina . Durante el recambio, se observan semiquinonas neutras y aniónicas, lo que indica un mecanismo radical. [23]
La prenilcisteína liasa (PCLasa) cataliza la escisión de la prenilcisteína (una modificación de la proteína) para formar un aldehído isoprenoide y el residuo de cisteína liberado en la proteína objetivo. El FAD está unido de forma no covalente a PCLase. No se han realizado muchos estudios mecanicistas que analicen las reacciones de la flavina, pero el mecanismo propuesto se muestra a continuación. Se propone una transferencia de hidruro desde el C1 del resto prenilo a FAD, lo que da como resultado la reducción de la flavina a FADH 2 . COformED ES un carbocatión estabilizado por el átomo de azufre vecino. Luego, FADH 2 reacciona con el oxígeno molecular para restaurar la enzima oxidada. [23]
La UDP-N-acetilenolpiruvilglucosamina reductasa (MurB) es una enzima que cataliza la reducción dependiente de NADPH de la enolpiruvil-UDP-N-acetilglucosamina (sustrato) al correspondiente compuesto D-lactilo, ácido UDP-N-acetilmurámico (producto). MurB es un monómero y contiene una molécula de FAD. Antes de que el sustrato pueda convertirse en producto, el NADPH primero debe reducir el FAD. Una vez que NADP + se disocia, el sustrato puede unirse y la flavina reducida puede reducir el producto. [23]
La glutatión reductasa (GR) cataliza la reducción del disulfuro de glutatión (GSSG) a glutatión (GSH). GR requiere FAD y NADPH para facilitar esta reacción; Primero se debe transferir un hidruro de NADPH a FAD. La flavina reducida puede actuar entonces como un nucleófilo para atacar el disulfuro, lo que forma el aducto C4a-cisteína. La eliminación de este aducto da como resultado un complejo de transferencia de carga de flavina-tiolato. [23]
Las enzimas del tipo citocromo P450 que catalizan reacciones de monooxigenasa (hidroxilación) dependen de la transferencia de dos electrones del FAD al P450. En los eucariotas se encuentran dos tipos de sistemas P450. Los sistemas P450 que se encuentran en el retículo endoplásmico dependen de una citocromo P-450 reductasa (CPR) que contiene tanto un FAD como un FMN . Los dos electrones del FAD reducido (FADH 2 ) se transfieren uno a la vez al FMN y luego se pasa un solo electrón del FMN al hemo del P450. [24]
Los sistemas P450 que se encuentran en las mitocondrias dependen de dos proteínas de transferencia de electrones: una FAD que contiene adrenodoxina reductasa (AR) y un pequeño grupo de hierro-azufre que contiene una proteína llamada adrenodoxina . FAD está integrado en el dominio de unión a FAD de AR. [25] [26] El FAD de AR se reduce a FADH 2 mediante la transferencia de dos electrones del NADPH que se une al dominio de unión a NADP de AR. La estructura de esta enzima está altamente conservada para mantener con precisión la alineación del donante de electrones NADPH y el aceptor FAD para una transferencia de electrones eficiente. [26] Los dos electrones en el FAD reducido se transfieren uno a la vez a la adrenodoxina, que a su vez dona el único electrón al grupo hemo del P450 mitocondrial. [27]
Las estructuras de la reductasa del sistema P450 microsomal frente a la reductasa mitocondrial son completamente diferentes y no muestran homología. [24]
La p -hidroxibenzoato hidroxilasa (PHBH) cataliza la oxigenación del p -hidroxibenzoato ( p OHB) a 3,4-dihidroxibenzoato (3,4-diOHB); Para esta reacción se requieren FAD, NADPH y oxígeno molecular. NADPH primero transfiere un hidruro equivalente a FAD, creando FADH − , y luego NADP + se disocia de la enzima. El PHBH reducido luego reacciona con el oxígeno molecular para formar el hidroperóxido de flavina-C(4a). El hidroperóxido de flavina hidroxila rápidamente p OHB y luego elimina el agua para regenerar la flavina oxidada. [23] Un mecanismo alternativo de oxigenación mediado por flavina implica el uso de un óxido de flavina-N(5) en lugar de un peróxido de flavina-C(4a)-(hidro). [2] [3]
La corismato sintasa (CS) cataliza el último paso de la vía del shikimato : la formación de corismato. Se conocen dos clases de CS, las cuales requieren FMN , pero están divididas en cuanto a su necesidad de NADPH como agente reductor. El mecanismo propuesto para CS involucra especies radicales. La especie radical flavina no se ha detectado espectroscópicamente sin utilizar un sustrato análogo, lo que sugiere que tiene una vida corta. Sin embargo, cuando se utilizó un sustrato fluorado, se detectó una flavina semiquinona neutra. [23]
La glutamato sintasa cataliza la conversión de 2-oxoglutarato en L-glutamato y la L-glutamina sirve como fuente de nitrógeno para la reacción. Todas las síntesis de glutamato son flavoproteínas hierro-azufre que contienen un grupo hierro-azufre y FMN. Las tres clases de síntesis de glutamato se clasifican según sus secuencias y propiedades bioquímicas. Aunque existen tres clases de esta enzima, se cree que todas operan mediante el mismo mecanismo, diferenciándose únicamente en lo que primero reduce el FMN. La enzima produce dos moléculas de glutamato: una por la hidrólisis de la glutamina (formando glutamato y amoníaco) y la segunda por el amoníaco producido en la primera reacción que ataca al 2-oxoglutarato, que el FMN reduce a glutamato. [23]
Debido a la importancia de las flavoproteínas , no es sorprendente que aproximadamente el 60% de las flavoproteínas humanas causen enfermedades humanas cuando mutan. [17] En algunos casos, esto se debe a una menor afinidad por FAD o FMN y, por lo tanto, la ingesta excesiva de riboflavina puede disminuir los síntomas de la enfermedad, como la deficiencia múltiple de acil-CoA deshidrogenasa . [9] Además, la deficiencia de riboflavina en sí (y la falta resultante de FAD y FMN) puede causar problemas de salud. [9] Por ejemplo, en pacientes con ELA , hay niveles reducidos de síntesis de FAD. [9] Ambas vías pueden provocar una variedad de síntomas, que incluyen anomalías gastrointestinales o del desarrollo, descomposición defectuosa de las grasas , anemia , problemas neurológicos, cáncer o enfermedades cardíacas , migraña , empeoramiento de la visión y lesiones cutáneas. [9] Por ello, la industria farmacéutica produce riboflavina para complementar la dieta en determinados casos. En 2008, la necesidad mundial de riboflavina era de 6.000 toneladas al año, con una capacidad de producción de 10.000 toneladas. [4] Este mercado de 150 a 500 millones de dólares no es sólo para aplicaciones médicas, sino que también se utiliza como complemento de los alimentos para animales en la industria agrícola y como colorante alimentario . [4]
El nuevo diseño de medicamentos antibacterianos sigue siendo de importancia en la investigación científica a medida que aumenta la resistencia bacteriana a los antibióticos comunes. Una proteína metabólica específica que utiliza FAD ( Complejo II ) es vital para la virulencia bacteriana, por lo que centrarse en la síntesis de FAD o crear análogos de FAD podría ser un área de investigación útil. [28] Los científicos ya han determinado las dos estructuras que FAD suele asumir una vez unida: una conformación extendida o de mariposa, en la que la molécula esencialmente se pliega por la mitad, lo que resulta en el apilamiento de los anillos de adenina e isoaloxazina. [14] Los imitadores de FAD que pueden unirse de manera similar pero que no permiten la función de las proteínas podrían ser mecanismos útiles para inhibir la infección bacteriana. [14] Alternativamente, los medicamentos que bloquean la síntesis de FAD podrían lograr el mismo objetivo; Esto es especialmente intrigante porque la síntesis de FAD humana y bacteriana se basa en enzimas muy diferentes, lo que significa que es poco probable que un fármaco elaborado para atacar la FAD sintasa bacteriana interfiera con las enzimas FAD sintasa humana. [29]
La optogenética permite el control de eventos biológicos de forma no invasiva. [30] El campo ha avanzado en los últimos años con una serie de nuevas herramientas, incluidas aquellas para activar la sensibilidad a la luz, como los dominios FAD que utilizan luz azul (BLUF). Los BLUF codifican una secuencia de 100 a 140 aminoácidos que se deriva de fotorreceptores en plantas y bacterias. [30] Al igual que otros fotorreceptores , la luz provoca cambios estructurales en el dominio BLUF que resultan en la interrupción de las interacciones posteriores. [30] La investigación actual investiga las proteínas con el dominio BLUF adjunto y cómo diferentes factores externos pueden afectar las proteínas. [30]
Hay una serie de moléculas en el cuerpo que tienen fluorescencia nativa , incluidas el triptófano, el colágeno , la FAD, la NADH y las porfirinas . [31] Los científicos han aprovechado esto usándolos para monitorear la progresión de la enfermedad o la efectividad del tratamiento o ayudar en el diagnóstico. Por ejemplo, la fluorescencia nativa de FAD y NADH varía en el tejido normal y en la fibrosis submucosa oral , lo que es un signo temprano de cáncer oral invasivo . [31] Por lo tanto, los médicos han estado empleando fluorescencia para ayudar en el diagnóstico y monitorear el tratamiento en lugar de la biopsia estándar . [31]
