En bioquímica , el dinucleótido de flavina y adenina ( FAD ) es una coenzima redox -activa asociada a varias proteínas , que está involucrada en varias reacciones enzimáticas del metabolismo . Una flavoproteína es una proteína que contiene un grupo flavina , que puede estar en forma de FAD o mononucleótido de flavina (FMN). Se conocen muchas flavoproteínas: componentes del complejo succinato deshidrogenasa, α-cetoglutarato deshidrogenasa y un componente del complejo piruvato deshidrogenasa .
El FAD puede existir en cuatro estados redox, que son el flavin-N(5)-óxido , la quinona , la semiquinona y la hidroquinona . [1] El FAD se convierte entre estos estados al aceptar o donar electrones. El FAD, en su forma completamente oxidada, o forma quinona , acepta dos electrones y dos protones para convertirse en FADH 2 (forma hidroquinona). La semiquinona (FADH · ) se puede formar por reducción del FAD o por oxidación del FADH 2 al aceptar o donar un electrón y un protón, respectivamente. Sin embargo, algunas proteínas generan y mantienen una forma superoxidada del cofactor de la flavina, el flavin-N(5)-óxido. [2] [3]
Las flavoproteínas se descubrieron por primera vez en 1879 al separar los componentes de la leche de vaca. Inicialmente se las llamó lactocromo debido a su origen lechoso y su pigmento amarillo . [4] La comunidad científica tardó 50 años en lograr un progreso sustancial en la identificación de las moléculas responsables del pigmento amarillo. La década de 1930 lanzó el campo de la investigación de coenzimas con la publicación de muchas estructuras derivadas de flavina y nicotinamida y sus funciones obligadas en la catálisis redox. Los científicos alemanes Otto Warburg y Walter Christian descubrieron una proteína amarilla derivada de levadura necesaria para la respiración celular en 1932. Su colega Hugo Theorell separó esta enzima amarilla en apoenzima y pigmento amarillo, y demostró que ni la enzima ni el pigmento eran capaces de oxidar NADH por sí solos, pero mezclándolos restaurarían la actividad. Theorell confirmó que el pigmento era el éster de fosfato de riboflavina , flavina mononucleótido (FMN) en 1937, que fue la primera evidencia directa de cofactores enzimáticos . [5] Warburg y Christian luego descubrieron que el FAD era un cofactor de la D-aminoácido oxidasa a través de experimentos similares en 1938. [6] El trabajo de Warburg con la vinculación de la nicotinamida a las transferencias de hidruro y el descubrimiento de las flavinas allanó el camino para que muchos científicos en los años 40 y 50 descubrieran grandes cantidades de bioquímica redox y las vincularan entre sí en vías como el ciclo del ácido cítrico y la síntesis de ATP .
El dinucleótido de flavina y adenina consta de dos partes: el nucleótido de adenina ( monofosfato de adenosina ) y el mononucleótido de flavina (FMN) unidos entre sí a través de sus grupos fosfato . La adenina está unida a una ribosa cíclica en el carbono 1' , mientras que el fosfato está unido a la ribosa en el carbono 5' para formar el nucleótido de adenina. La riboflavina se forma mediante un enlace carbono-nitrógeno (CN) entre la isoaloxazina y el ribitol . El grupo fosfato se une entonces al carbono terminal de la ribosa, formando un FMN. Debido a que el enlace entre la isoaloxazina y el ribitol no se considera un enlace glucosídico , el mononucleótido de flavina no es realmente un nucleótido. [7] Esto hace que el nombre del dinucleótido sea engañoso; sin embargo, el grupo del mononucleótido de flavina sigue estando muy cerca de un nucleótido en su estructura y propiedades químicas.
El FAD se puede reducir a FADH 2 mediante la adición de 2 H + y 2 e − . El FADH 2 también se puede oxidar mediante la pérdida de 1 H + y 1 e − para formar FADH. La forma FAD se puede recrear mediante la pérdida adicional de 1 H + y 1 e − . La formación de FAD también puede ocurrir mediante la reducción y deshidratación del óxido de flavina-N(5). [8] Según el estado de oxidación, las flavinas toman colores específicos cuando están en solución acuosa . El óxido de flavina-N(5) (superoxidado) es amarillo anaranjado, el FAD (completamente oxidado) es amarillo, el FADH (medio reducido) es azul o rojo según el pH , y la forma completamente reducida es incolora. [9] [10] Cambiar la forma puede tener un gran impacto en otras propiedades químicas. Por ejemplo, FAD, la forma completamente oxidada está sujeta a ataque nucleofílico , la forma completamente reducida, FADH 2 tiene alta polarizabilidad , mientras que la forma semirreducida es inestable en solución acuosa. [11] FAD es un sistema de anillo aromático , mientras que FADH 2 no lo es. [12] Esto significa que FADH 2 es significativamente más alto en energía, sin la estabilización a través de resonancia que proporciona la estructura aromática. FADH 2 es una molécula transportadora de energía, porque, una vez oxidada recupera aromaticidad y libera la energía representada por esta estabilización.
Las propiedades espectroscópicas del FAD y sus variantes permiten el monitoreo de la reacción mediante el uso de espectroscopias de absorción UV-VIS y fluorescencia . Cada forma de FAD tiene espectros de absorbancia distintos, lo que facilita la observación de los cambios en el estado de oxidación. [11] Se observa un máximo de absorbancia local importante para el FAD a 450 nm, con un coeficiente de extinción de 11.300 M −1 cm −1 . [13] Las flavinas en general tienen actividad fluorescente cuando no están unidas (las proteínas unidas a los derivados del ácido nucleico de la flavina se denominan flavoproteínas ). Esta propiedad se puede utilizar al examinar la unión de proteínas, observando la pérdida de actividad fluorescente cuando se colocan en el estado unido. [11] Las flavinas oxidadas tienen altas absorbancias de aproximadamente 450 nm y fluorescen a aproximadamente 515-520 nm. [9]
En los sistemas biológicos, el FAD actúa como aceptor de H + y e− en su forma completamente oxidada, como aceptor o donador en la forma FADH y como donador en la forma FADH 2 reducida . El diagrama siguiente resume los posibles cambios que puede sufrir.
Además de lo que se ve arriba, se pueden formar y consumir otras formas reactivas de FAD. Estas reacciones implican la transferencia de electrones y la formación/ruptura de enlaces químicos . A través de mecanismos de reacción , el FAD puede contribuir a las actividades químicas dentro de los sistemas biológicos. Las siguientes imágenes representan formas generales de algunas de las acciones en las que puede participar el FAD.
Los mecanismos 1 y 2 representan la ganancia de hidruro , en la que la molécula gana lo que equivale a un ion hidruro. Los mecanismos 3 y 4 forman radicales y pierden hidruro. Las especies radicales contienen átomos de electrones desapareados y son muy activas químicamente. La pérdida de hidruro es el proceso inverso de la ganancia de hidruro vista anteriormente. Los dos mecanismos finales muestran la adición nucleofílica y una reacción que utiliza un radical de carbono.
El FAD juega un papel importante como cofactor enzimático junto con el mononucleótido de flavina , otra molécula que se origina a partir de la riboflavina. [8] Las bacterias, los hongos y las plantas pueden producir riboflavina , pero otros eucariotas , como los humanos, han perdido la capacidad de producirla. [9] Por lo tanto, los humanos deben obtener riboflavina, también conocida como vitamina B2, de fuentes dietéticas. [14] La riboflavina generalmente se ingiere en el intestino delgado y luego se transporta a las células a través de proteínas transportadoras. [9] La riboflavina quinasa (EC 2.7.1.26) agrega un grupo fosfato a la riboflavina para producir mononucleótido de flavina, y luego la FAD sintetasa une un nucleótido de adenina ; ambos pasos requieren ATP . [9] Las bacterias generalmente tienen una enzima bifuncional, pero las arqueas y los eucariotas generalmente emplean dos enzimas distintas. [9] La investigación actual indica que existen isoformas distintas en el citosol y las mitocondrias . [9] Parece que el FAD se sintetiza en ambos lugares y potencialmente se transporta donde sea necesario. [11]
Las flavoproteínas utilizan la estructura única y versátil de las fracciones de flavina para catalizar reacciones redox difíciles. Dado que las flavinas tienen múltiples estados redox, pueden participar en procesos que involucran la transferencia de uno o dos electrones, átomos de hidrógeno o iones hidronio . El N5 y C4a del anillo de flavina completamente oxidado también son susceptibles al ataque nucleofílico . [15] Esta amplia variedad de ionización y modificación de la fracción de flavina se puede atribuir al sistema de anillo de isoaloxazina y a la capacidad de las flavoproteínas de perturbar drásticamente los parámetros cinéticos de las flavinas al unirse, incluido el dinucleótido de flavina y adenina (FAD).
La cantidad de genes codificados por proteínas dependientes de flavina en el genoma (el flavoproteoma) depende de la especie y puede variar entre el 0,1 % y el 3,5 %, y los humanos tienen 90 genes codificados por flavoproteínas. [16] La FAD es la forma más compleja y abundante de flavina y se informa que se une al 75 % del flavoproteoma total [16] y al 84 % de las flavoproteínas codificadas por humanos. [17] Se informaron concentraciones celulares de flavinas libres o unidas de forma no covalente en una variedad de líneas celulares de mamíferos cultivados para FAD (2,2-17,0 amol/célula) y FMN (0,46-3,4 amol/célula). [18]
El FAD tiene un potencial de reducción más positivo que el NAD+ y es un agente oxidante muy fuerte. La célula lo utiliza en muchas reacciones de oxidación energéticamente difíciles, como la deshidrogenación de un enlace CC a un alqueno . Las proteínas dependientes de FAD funcionan en una gran variedad de vías metabólicas, incluido el transporte de electrones, la reparación del ADN, la biosíntesis de nucleótidos, la betaoxidación de ácidos grasos, el catabolismo de aminoácidos, así como la síntesis de otros cofactores como CoA , CoQ y grupos hemo . Una reacción bien conocida es parte del ciclo del ácido cítrico (también conocido como TCA o ciclo de Krebs); la succinato deshidrogenasa (complejo II en la cadena de transporte de electrones ) requiere FAD unido covalentemente para catalizar la oxidación de succinato a fumarato acoplándolo con la reducción de ubiquinona a ubiquinol . [11] Los electrones de alta energía de esta oxidación se almacenan momentáneamente al reducir FAD a FADH 2 . FADH 2 luego se revierte a FAD, enviando sus dos electrones de alta energía a través de la cadena de transporte de electrones; la energía en FADH 2 es suficiente para producir 1,5 equivalentes de ATP [19] por fosforilación oxidativa . Algunas flavoproteínas redox se unen de forma no covalente a FAD como las acetil-CoA-deshidrogenasas que están implicadas en la beta-oxidación de ácidos grasos y el catabolismo de aminoácidos como leucina ( isovaleril-CoA deshidrogenasa ), isoleucina (acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta/ramificada), valina (isobutiril-CoA deshidrogenasa) y lisina ( glutaril-CoA deshidrogenasa ). [20] Otros ejemplos de enzimas dependientes de FAD que regulan el metabolismo son la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (síntesis de triglicéridos) y la xantina oxidasa implicadas en el catabolismo de nucleótidos de purina . [21] Las funciones no catalíticas que el FAD puede desempeñar en las flavoproteínas incluyen funciones estructurales o estar involucrado en los fotorreceptores de luz sensibles a la luz azul que regulan los relojes biológicos y el desarrollo, y la generación de luz en bacterias bioluminiscentes . [20]
Las flavoproteínas tienen una molécula de FMN o FAD como grupo prostético, este grupo prostético puede estar unido fuertemente o enlazado covalentemente. Solo alrededor del 5-10% de las flavoproteínas tienen un FAD enlazado covalentemente, pero estas enzimas tienen un poder redox más fuerte. [11] En algunos casos, el FAD puede proporcionar soporte estructural para sitios activos o proporcionar estabilización de intermediarios durante la catálisis. [20] Con base en los datos estructurales disponibles, los sitios de unión de FAD conocidos se pueden dividir en más de 200 tipos. [22]
En el genoma humano están codificadas 90 flavoproteínas; alrededor del 84% requiere FAD, y alrededor del 16% requiere FMN, mientras que 5 proteínas requieren que ambos estén presentes. [17] Las flavoproteínas se encuentran principalmente en las mitocondrias debido a su poder redox. [17] De todas las flavoproteínas, el 90% realiza reacciones redox y el otro 10% son transferasas , liasas , isomerasas , ligasas . [16]
La monoaminooxidasa (MAO) es una flavoenzima ampliamente estudiada debido a su importancia biológica en el catabolismo de la noradrenalina , la serotonina y la dopamina . La MAO oxida aminas primarias, secundarias y terciarias, que se hidrolizan de forma no enzimática a partir de la imina a aldehído o cetona . Aunque esta clase de enzima ha sido ampliamente estudiada, su mecanismo de acción aún se debate. Se han propuesto dos mecanismos: un mecanismo radical y un mecanismo nucleofílico. El mecanismo radical es menos aceptado en general porque no existe evidencia espectral o de resonancia paramagnética electrónica de la presencia de un intermediario radical. El mecanismo nucleofílico es más favorecido porque está respaldado por estudios de mutagénesis dirigida al sitio que mutaron dos residuos de tirosina que se esperaba que aumentaran la nucleofilia de los sustratos. [23]
La glucosa oxidasa (GOX) cataliza la oxidación de β-D-glucosa a D-glucono-δ-lactona con la reducción simultánea de la flavina unida a la enzima. La GOX existe como un homodímero, en el que cada subunidad se une a una molécula de FAD. Las estructuras cristalinas muestran que el FAD se une en un bolsillo profundo de la enzima cerca de la interfaz del dímero. Los estudios demostraron que tras la sustitución del FAD por 8-hidroxi-5-carba-5-deaza FAD, la estereoquímica de la reacción se determinó reaccionando con la cara re de la flavina. Durante el recambio, se observan las semiquinonas neutras y aniónicas, lo que indica un mecanismo radical. [23]
La prenilcisteína liasa (PCLasa) cataliza la escisión de la prenilcisteína (una modificación de la proteína) para formar un aldehído isoprenoide y el residuo de cisteína liberado en la proteína diana. El FAD está unido de forma no covalente a la PCLasa. No se han realizado muchos estudios mecanísticos que examinen las reacciones de la flavina, pero el mecanismo propuesto se muestra a continuación. Se propone una transferencia de hidruro desde el C1 de la fracción prenil a FAD, lo que da como resultado la reducción de la flavina a FADH 2 . El COformado es un carbocatión que se estabiliza mediante el átomo de azufre vecino. Luego, el FADH 2 reacciona con el oxígeno molecular para restaurar la enzima oxidada. [23]
La UDP-N-acetilenolpiruvilglucosamina reductasa (MurB) es una enzima que cataliza la reducción dependiente de NADPH de la enolpiruvil-UDP-N-acetilglucosamina (sustrato) al compuesto D-láctil correspondiente, ácido UDP-N-acetilmurámico (producto). La MurB es un monómero y contiene una molécula de FAD. Antes de que el sustrato pueda convertirse en producto, el NADPH debe reducir primero el FAD. Una vez que el NADP + se disocia, el sustrato puede unirse y la flavina reducida puede reducir el producto. [23]
La glutatión reductasa (GR) cataliza la reducción del disulfuro de glutatión (GSSG) a glutatión (GSH). La GR requiere FAD y NADPH para facilitar esta reacción; primero se debe transferir un hidruro de NADPH a FAD. La flavina reducida puede entonces actuar como un nucleófilo para atacar el disulfuro, esto forma el aducto C4a-cisteína. La eliminación de este aducto da como resultado un complejo de transferencia de carga flavina-tiolato. [23]
Las enzimas del tipo citocromo P450 que catalizan las reacciones de monooxigenasa (hidroxilación) dependen de la transferencia de dos electrones del FAD al P450. En los eucariotas se encuentran dos tipos de sistemas P450. Los sistemas P450 que se encuentran en el retículo endoplasmático dependen de una citocromo P-450 reductasa (CPR) que contiene tanto un FAD como un FMN . Los dos electrones del FAD reducido (FADH 2 ) se transfieren uno a la vez al FMN y luego un solo electrón pasa del FMN al hemo del P450. [24]
Los sistemas P450 que se encuentran en las mitocondrias dependen de dos proteínas de transferencia de electrones: una FAD que contiene adrenodoxina reductasa (AR) y una proteína que contiene un pequeño grupo hierro-azufre llamada adrenodoxina . La FAD está incrustada en el dominio de unión de FAD de AR. [25] [26] La FAD de AR se reduce a FADH 2 mediante la transferencia de dos electrones de NADPH que se une en el dominio de unión de NADP de AR. La estructura de esta enzima está altamente conservada para mantener con precisión la alineación del donador de electrones NADPH y el aceptor FAD para una transferencia de electrones eficiente. [26] Los dos electrones en la FAD reducida se transfieren uno a la vez a la adrenodoxina que a su vez dona el electrón único al grupo hemo del P450 mitocondrial. [27]
Las estructuras de la reductasa del sistema microsomal versus la reductasa del sistema mitocondrial P450 son completamente diferentes y no muestran homología. [24]
La p -hidroxibenzoato hidroxilasa (PHBH) cataliza la oxigenación del p- hidroxibenzoato ( pOHB ) a 3,4-dihidroxibenzoato (3,4-diOHB); para esta reacción se requieren FAD, NADPH y oxígeno molecular. El NADPH primero transfiere un hidruro equivalente a FAD, creando FADH − , y luego el NADP + se disocia de la enzima. El PHBH reducido luego reacciona con el oxígeno molecular para formar el hidroperóxido de flavina-C(4a). El hidroperóxido de flavina hidroxila rápidamente el pOHB y luego elimina el agua para regenerar la flavina oxidada. [23] Un mecanismo alternativo de oxigenación mediada por flavina implica el uso de un flavin-N(5)-óxido en lugar de un flavin-C(4a)-(hidro)peróxido. [2] [3]
La corismato sintasa (CS) cataliza el último paso en la vía del shikimato : la formación de corismato. Se conocen dos clases de CS, las cuales requieren FMN , pero están divididas en su necesidad de NADPH como agente reductor. El mecanismo propuesto para la CS involucra especies radicales. La especie radical flavina no ha sido detectada espectroscópicamente sin usar un análogo de sustrato, lo que sugiere que tiene una vida corta. Sin embargo, cuando se usa un sustrato fluorado, se detectó una semiquinona de flavina neutra. [23]
La glutamato sintasa cataliza la conversión de 2-oxoglutarato en L-glutamato, siendo la L-glutamina la fuente de nitrógeno para la reacción. Todas las síntesis de glutamato son flavoproteínas de hierro-azufre que contienen un grupo de hierro-azufre y FMN. Las tres clases de síntesis de glutamato se clasifican en función de sus secuencias y propiedades bioquímicas. Aunque existen tres clases de esta enzima, se cree que todas funcionan a través del mismo mecanismo, y que solo se diferencian en lo que primero reduce el FMN. La enzima produce dos moléculas de glutamato: una por hidrólisis de glutamina (formando glutamato y amoníaco), y la segunda por el amoníaco producido a partir de la primera reacción que ataca al 2-oxoglutarato, que es reducido por FMN a glutamato. [23]
Debido a la importancia de las flavoproteínas , no es sorprendente que aproximadamente el 60% de las flavoproteínas humanas causen enfermedades humanas cuando mutan. [17] En algunos casos, esto se debe a una menor afinidad por FAD o FMN y, por lo tanto, la ingesta excesiva de riboflavina puede disminuir los síntomas de la enfermedad, como la deficiencia múltiple de acil-CoA deshidrogenasa . [9] Además, la deficiencia de riboflavina en sí misma (y la falta resultante de FAD y FMN) puede causar problemas de salud. [9] Por ejemplo, en pacientes con ELA , hay niveles disminuidos de síntesis de FAD. [9] Ambas vías pueden resultar en una variedad de síntomas, que incluyen anomalías del desarrollo o gastrointestinales, descomposición defectuosa de las grasas , anemia , problemas neurológicos, cáncer o enfermedad cardíaca , migraña , empeoramiento de la visión y lesiones cutáneas. [9] Por lo tanto, la industria farmacéutica produce riboflavina para complementar la dieta en ciertos casos. En 2008, la necesidad mundial de riboflavina era de 6.000 toneladas al año, con una capacidad de producción de 10.000 toneladas. [4] Este mercado de 150 a 500 millones de dólares no es sólo para aplicaciones médicas, sino que también se utiliza como suplemento de alimentos para animales en la industria agrícola y como colorante alimentario . [4]
El diseño de nuevos medicamentos antibacterianos sigue siendo de importancia en la investigación científica a medida que aumenta la resistencia bacteriana a los antibióticos comunes. Una proteína metabólica específica que utiliza FAD ( Complejo II ) es vital para la virulencia bacteriana, por lo que apuntar a la síntesis de FAD o crear análogos de FAD podría ser un área útil de investigación. [28] Ya los científicos han determinado las dos estructuras que generalmente asume FAD una vez unido: una conformación extendida o una conformación de mariposa, en la que la molécula esencialmente se pliega a la mitad, lo que resulta en el apilamiento de los anillos de adenina e isoaloxazina. [14] Los imitadores de FAD que pueden unirse de manera similar pero no permiten la función de la proteína podrían ser mecanismos útiles para inhibir la infección bacteriana. [14] Alternativamente, los medicamentos que bloquean la síntesis de FAD podrían lograr el mismo objetivo; esto es especialmente intrigante porque la síntesis de FAD humana y bacteriana depende de enzimas muy diferentes, lo que significa que un medicamento creado para apuntar a la sintasa de FAD bacteriana sería poco probable que interfiriera con las enzimas de la sintasa de FAD humana. [29]
La optogenética permite controlar eventos biológicos de una manera no invasiva. [30] El campo ha avanzado en los últimos años con una serie de nuevas herramientas, incluidas aquellas para activar la sensibilidad a la luz, como los dominios FAD que utilizan luz azul (BLUF). Los BLUF codifican una secuencia de 100 a 140 aminoácidos que se deriva de fotorreceptores en plantas y bacterias. [30] De manera similar a otros fotorreceptores , la luz causa cambios estructurales en el dominio BLUF que resultan en la interrupción de las interacciones posteriores. [30] La investigación actual investiga las proteínas con el dominio BLUF adjunto y cómo diferentes factores externos pueden afectar las proteínas. [30]
Hay varias moléculas en el cuerpo que tienen fluorescencia nativa , incluyendo triptófano, colágeno , FAD, NADH y porfirinas . [31] Los científicos han aprovechado esto al utilizarlas para monitorear la progresión de la enfermedad o la efectividad del tratamiento o ayudar en el diagnóstico. Por ejemplo, la fluorescencia nativa de un FAD y NADH varía en el tejido normal y la fibrosis submucosa oral , que es un signo temprano de cáncer oral invasivo . [31] Por lo tanto, los médicos han estado empleando la fluorescencia para ayudar en el diagnóstico y monitorear el tratamiento en lugar de la biopsia estándar . [31]
