Una tríada catalítica es un conjunto de tres aminoácidos coordinados que se pueden encontrar en el sitio activo de algunas enzimas . [1] [2] Las tríadas catalíticas se encuentran más comúnmente en las enzimas hidrolasa y transferasa (p. ej., proteasas , amidasas , esterasas , acilasas , lipasas y β-lactamasas ). Una tríada ácido - base - nucleófilo es un motivo común para generar un residuo nucleófilo para la catálisis covalente . Los residuos forman una red de retransmisión de carga para polarizar y activar el nucleófilo, que ataca al sustrato , formando un intermediario covalente que luego se hidroliza para liberar el producto y regenerar la enzima libre. El nucleófilo suele ser un aminoácido de serina o cisteína , pero ocasionalmente treonina o incluso selenocisteína . La estructura tridimensional de la enzima reúne los residuos de la tríada en una orientación precisa, aunque puedan estar muy separados en la secuencia ( estructura primaria ). [3]
Además de la evolución divergente de la función (e incluso del nucleófilo de la tríada), las tríadas catalíticas muestran algunos de los mejores ejemplos de evolución convergente . Las limitaciones químicas de la catálisis han llevado a que la misma solución catalítica evolucione de forma independiente en al menos 23 superfamilias distintas . [2] Su mecanismo de acción es, por tanto, uno de los mejor estudiados en bioquímica . [4] [5]
Las enzimas tripsina y quimotripsina se purificaron por primera vez en la década de 1930. [6] En la década de 1950 se identificó una serina en tripsina y quimotripsina como el nucleófilo catalítico (mediante modificación con fluorofosfato de diisopropilo ). [7] La estructura de la quimotripsina se resolvió mediante cristalografía de rayos X en la década de 1960, mostrando la orientación de la tríada catalítica en el sitio activo. [8] Se secuenciaron y alinearon otras proteasas para revelar una familia de proteasas relacionadas, [9] [10] [11] ahora llamada familia S1. Al mismo tiempo, se descubrió que las estructuras de las proteasas papaína y subtilisina, no relacionadas evolutivamente , contenían tríadas análogas. El mecanismo de "retransmisión de carga" para la activación del nucleófilo por los otros miembros de la tríada fue propuesto a finales de los años 1960. [12] A medida que se resolvieron más estructuras de proteasa mediante cristalografía de rayos X en las décadas de 1970 y 1980, se encontraron tríadas homólogas (como la proteasa TEV ) y análogas (como la papaína). [13] [14] [15] El sistema de clasificación MEROPS en las décadas de 1990 y 2000 comenzó a clasificar las proteasas en superfamilias de enzimas estructuralmente relacionadas y, por lo tanto, actúa como una base de datos de la evolución convergente de tríadas en más de 20 superfamilias. [16] [17] En la década de 2010 se ha desarrollado la comprensión de cómo las limitaciones químicas de la evolución condujeron a la convergencia de tantas familias de enzimas en las mismas geometrías de tríada. [2]
Desde su descubrimiento inicial, se han realizado investigaciones cada vez más detalladas sobre su mecanismo catalítico exacto. De particular controversia en las décadas de 1990 y 2000 fue si los enlaces de hidrógeno de baja barrera contribuían a la catálisis, [18] [19] [20] o si los enlaces de hidrógeno ordinarios son suficientes para explicar el mecanismo. [21] [22] La enorme cantidad de trabajo sobre la catálisis covalente de relé de carga utilizada por las tríadas catalíticas ha llevado a que el mecanismo sea el mejor caracterizado de toda la bioquímica. [4] [5] [21]
Las enzimas que contienen una tríada catalítica la utilizan para uno de dos tipos de reacción: para dividir un sustrato ( hidrolasas ) o para transferir una porción de un sustrato a un segundo sustrato ( transferasas ). Las tríadas son un conjunto interdependiente de residuos en el sitio activo de una enzima y actúan en conjunto con otros residuos (por ejemplo, sitio de unión y agujero de oxianión ) para lograr la catálisis nucleofílica . Estos residuos de la tríada actúan juntos para hacer que el miembro nucleófilo sea altamente reactivo , generando un intermediario covalente con el sustrato que luego se resuelve para completar la catálisis. [ cita necesaria ]
Las tríadas catalíticas realizan catálisis covalente utilizando un residuo como nucleófilo. La reactividad del residuo nucleofílico aumenta con los grupos funcionales de los otros miembros de la tríada. El nucleófilo está polarizado y orientado por la base, que a su vez está unida y estabilizada por el ácido. [ cita necesaria ]
La catálisis se realiza en dos etapas. Primero, el nucleófilo activado ataca el carbono carbonilo y obliga al oxígeno del carbonilo a aceptar un par de electrones, lo que conduce a un intermedio tetraédrico . La acumulación de carga negativa en este intermediario normalmente se estabiliza mediante un agujero de oxianión dentro del sitio activo. Luego, el intermedio colapsa nuevamente hasta convertirse en carbonilo, expulsando la primera mitad del sustrato, pero dejando la segunda mitad todavía unida covalentemente a la enzima como un intermedio acil-enzima . Aunque la catálisis ácida general para la descomposición del primer y segundo intermediario tetraédrico puede ocurrir por la ruta que se muestra en el diagrama, la evidencia que respalda este mecanismo con quimotripsina [23] ha sido controvertida. [24]
La segunda etapa de la catálisis es la resolución del intermedio acil-enzima mediante el ataque de un segundo sustrato. Si este sustrato es agua entonces el resultado es la hidrólisis; si es una molécula orgánica, entonces el resultado es la transferencia de esa molécula al primer sustrato. El ataque de este segundo sustrato forma un nuevo intermediario tetraédrico, que se resuelve expulsando el nucleófilo de la enzima, liberando el segundo producto y regenerando la enzima libre. [25]
La cadena lateral del residuo nucleofílico realiza catálisis covalente en el sustrato . El único par de electrones presentes en el oxígeno o el azufre ataca al carbono carbonilo electropositivo . [3] Los 20 aminoácidos biológicos naturales no contienen grupos funcionales suficientemente nucleofílicos para muchas reacciones catalíticas difíciles . Incrustar el nucleófilo en una tríada aumenta su reactividad para una catálisis eficiente. Los nucleófilos más comúnmente utilizados son el hidroxilo (OH) de la serina y el ion tiol /tiolato (SH/S − ) de la cisteína. [2] Alternativamente, las treonina proteasas usan el hidroxilo secundario de la treonina; sin embargo, debido al impedimento estérico del grupo metilo adicional de la cadena lateral, dichas proteasas usan su amida N -terminal como base, en lugar de un aminoácido separado. [1] [26]
El uso de oxígeno o azufre como átomo nucleofílico provoca diferencias menores en la catálisis. En comparación con el oxígeno , el orbital d adicional del azufre lo hace más grande (0,4 Å) [27] y más suave, le permite formar enlaces más largos (d C-X y d X-H 1,3 veces) y le da un p K a más bajo. (por 5 unidades). [28] Por lo tanto, la serina depende más que la cisteína de la orientación óptima de los miembros de la tríada ácido-base para reducir su p K a [28] con el fin de lograr una desprotonación concertada con catálisis. [2] El bajo p K a de la cisteína es perjudicial para la resolución del primer intermedio tetraédrico, ya que la inversión improductiva del ataque nucleofílico original es el producto de degradación más favorable. [2] Por lo tanto, la base de la tríada está orientada preferentemente para protonar la amida del grupo saliente para garantizar que se expulse para dejar la enzima azufre unida covalentemente al extremo N del sustrato. Finalmente, la resolución de la acilenzima (para liberar el sustrato C-terminal) requiere que la serina sea reprotonada mientras que la cisteína puede salir como S − . Estéricamente , el azufre de la cisteína también forma enlaces más largos y tiene un radio de van der Waals más voluminoso [2] y, si se muta a serina, puede quedar atrapado en orientaciones improductivas en el sitio activo. [27]
Muy raramente se utiliza como nucleófilo el átomo de selenio del aminoácido poco común selenocisteína . [29] El estado Se desprotonado se ve fuertemente favorecido cuando se encuentra en una tríada catalítica. [29]
Dado que ningún aminoácido natural es fuertemente nucleófilo, la base de una tríada catalítica polariza y desprotona el nucleófilo para aumentar su reactividad. [3] Además, protona el primer producto para ayudar a la salida del grupo. [ cita necesaria ]
La base suele ser histidina, ya que su p K a permite una catálisis básica eficaz, enlaces de hidrógeno al residuo ácido y desprotonación del residuo nucleófilo. [1] Las β-lactamasas como TEM-1 utilizan un residuo de lisina como base. Debido a que el p K a de la lisina es tan alto (p K a =11), un glutamato y varios otros residuos actúan como ácido para estabilizar su estado desprotonado durante el ciclo catalítico. [30] [31] Las treonina proteasas utilizan su amida N -terminal como base, ya que el hacinamiento estérico por el metilo de la treonina catalítica evita que otros residuos estén lo suficientemente cerca. [32] [33]
El miembro de la tríada ácida forma un enlace de hidrógeno con el residuo básico. Esto alinea el residuo básico restringiendo la rotación de su cadena lateral y lo polariza estabilizando su carga positiva. [3] Dos aminoácidos tienen cadenas laterales ácidas a pH fisiológico (aspartato o glutamato) y, por lo tanto, son los más comúnmente utilizados para este miembro de la tríada. [3] La proteasa del citomegalovirus [b] utiliza un par de histidinas, una como base, como de costumbre, y otra como ácido. [1] La segunda histidina no es un ácido tan eficaz como el aspartato o glutamato más común, lo que lleva a una menor eficiencia catalítica. En algunas enzimas, el miembro ácido de la tríada es menos necesario y algunas actúan sólo como una díada. Por ejemplo, la papaína [c] utiliza asparagina como su tercer miembro de la tríada que orienta la base de histidina pero no actúa como un ácido. De manera similar, la proteasa [d] del virus de la hepatitis A contiene agua ordenada en la posición donde debería estar un residuo ácido. [ cita necesaria ]
El motivo serina-histidina-aspartato es uno de los motivos catalíticos mejor caracterizados en bioquímica. [3] La tríada está ejemplificada por la quimotripsina , [e] una serina proteasa modelo de la superfamilia PA que utiliza su tríada para hidrolizar las cadenas principales de proteínas. El aspartato está unido por enlaces de hidrógeno a la histidina, lo que aumenta el p K a de su nitrógeno imidazol de 7 a alrededor de 12. Esto permite que la histidina actúe como una poderosa base general y active el nucleófilo de serina. También tiene un agujero de oxianión que consta de varias amidas principales que estabiliza la acumulación de carga en los intermedios. La base de histidina ayuda al primer grupo saliente donando un protón y también activa el sustrato de agua hidrolítica extrayendo un protón mientras el OH restante ataca al intermedio acil-enzima. [ cita necesaria ]
La misma tríada también ha evolucionado de manera convergente en α/β hidrolasas, como algunas lipasas y esterasas , sin embargo, la orientación de los miembros de la tríada está invertida. [34] [35] Además, también se ha descubierto que la acetil hidrolasa cerebral (que tiene el mismo pliegue que una pequeña proteína G ) tiene esta tríada. La tríada equivalente Ser-His- Glu se utiliza en la acetilcolinesterasa . [ cita necesaria ]
La segunda tríada más estudiada es el motivo cisteína-histidina-aspartato. [2] Varias familias de cisteína proteasas utilizan este conjunto de tríadas, por ejemplo TEV proteasa [a] y papaína . [c] La tríada actúa de manera similar a las tríadas de serina proteasa, con algunas diferencias notables. Debido a la baja p K a de la cisteína , la importancia del Asp para la catálisis varía y varias cisteína proteasas son efectivamente díadas Cys-His (por ejemplo, proteasa del virus de la hepatitis A ), mientras que en otras la cisteína ya está desprotonada antes de que comience la catálisis (por ejemplo, papaína). [36] Esta tríada también es utilizada por algunas amidasas, como la N -glicanasa para hidrolizar enlaces CN no peptídicos. [37]
La tríada de proteasa del citomegalovirus [b] utiliza histidina como miembro de la tríada ácida y básica. La eliminación de la histidina ácida produce sólo una pérdida de actividad 10 veces mayor (en comparación con >10 000 veces cuando se elimina el aspartato de la quimotripsina). Esta tríada se ha interpretado como una posible forma de generar una enzima menos activa para controlar la tasa de escisión. [26]
Una tríada inusual se encuentra en las proteasas de sedolisina . [f] El bajo p K a del grupo glutamato carboxilato significa que solo actúa como base en la tríada a un pH muy bajo. Se supone que la tríada es una adaptación a ambientes específicos como aguas termales ácidas (por ejemplo, kumamolisina) o lisosomas celulares (por ejemplo, tripeptidil peptidasa ). [26]
La proteasa endotelial vasohibina [g] utiliza una cisteína como nucleófilo, pero una serina para coordinar la base de histidina. [38] [39] A pesar de que la serina es un ácido pobre, sigue siendo eficaz para orientar la histidina en la tríada catalítica. [38] Algunos homólogos tienen alternativamente una treonina en lugar de serina en la ubicación ácida. [38]
Las treonina proteasas, como la subunidad de proteasa del proteasoma [h] y las ornitina aciltransferasas [i] utilizan el hidroxilo secundario de la treonina de una manera análoga al uso del hidroxilo primario de serina . [32] [33] Sin embargo, debido a la interferencia estérica del grupo metilo adicional de la treonina, el miembro base de la tríada es la amida N -terminal que polariza un agua ordenada que, a su vez, desprotona el hidroxilo catalítico para aumentar su reactividad. [1] [26] De manera similar, existen configuraciones equivalentes de 'sólo serina' y 'sólo cisteína', como la penicilina acilasa G [j] y la penicilina acilasa V [k] , que están relacionadas evolutivamente con las proteasas del proteasoma. Nuevamente, estos usan su amida N -terminal como base. [26]
Esta tríada inusual ocurre sólo en una superfamilia de amidasas. En este caso, la lisina actúa polarizando la serina media. [40] La serina intermedia luego forma dos fuertes enlaces de hidrógeno con la serina nucleofílica para activarla (uno con la cadena lateral hidroxilo y el otro con la amida principal). La serina media se mantiene en una orientación cis inusual para facilitar contactos precisos con los otros dos residuos de la tríada. La tríada es además inusual porque la lisina y la cis -serina actúan como base para activar la serina catalítica, pero la misma lisina también desempeña el papel del miembro ácido además de establecer contactos estructurales clave. [40] [41]
El aminoácido selenocisteína (Sec), raro pero natural, también se puede encontrar como nucleófilo en algunas tríadas catalíticas. [29] La selenocisteína es similar a la cisteína, pero contiene un átomo de selenio en lugar de azufre. Un ejemplo es el sitio activo de la tioredoxina reductasa , que utiliza el selenio para reducir el disulfuro en la tioredoxina. [29]
Además de los tipos de tríadas catalíticas que ocurren naturalmente, la ingeniería de proteínas se ha utilizado para crear variantes enzimáticas con aminoácidos no nativos o aminoácidos completamente sintéticos. [42] También se han insertado tríadas catalíticas en proteínas que de otro modo no serían catalíticas, o imitadores de proteínas. [ cita necesaria ]
Se ha reemplazado el nucleófilo de oxígeno de la subtilisina (una serina proteasa) por azufre, [43] [44] selenio , [45] o telurio . [46] La cisteína y la selenocisteína se insertaron mediante mutagénesis , mientras que el aminoácido no natural, la telurocisteína , se insertó utilizando células auxotróficas alimentadas con telurocisteína sintética. Todos estos elementos están en la columna 16 de la tabla periódica ( calcógenos ), por lo que tienen propiedades similares. [47] [48] En cada caso, el cambio del nucleófilo redujo la actividad proteasa de la enzima, pero aumentó una actividad diferente. Un nucleófilo de azufre mejoró la actividad de las enzimas transferasa (a veces llamada subtiligasa). Los nucleófilos de selenio y telurio convirtieron la enzima en una oxidorreductasa . [45] [46] Cuando el nucleófilo de la proteasa TEV se convirtió de cisteína a serina, su actividad proteasa se redujo fuertemente, pero pudo restaurarse mediante evolución dirigida . [49]
Se han utilizado proteínas no catalíticas como andamios, a las que se les han insertado tríadas catalíticas que luego se mejoraron mediante evolución dirigida. La tríada Ser-His-Asp se ha insertado en un anticuerpo, [50] así como en una variedad de otras proteínas. [51] De manera similar, se han creado imitadores de tríadas catalíticas en pequeñas moléculas orgánicas como diaril diseleniuro, [52] [53] y se han mostrado en polímeros más grandes como resinas Merrifield , [54] y nanoestructuras peptídicas cortas autoensambladas . [55]
La sofisticación de la red de sitios activos hace que los residuos implicados en la catálisis (y los residuos en contacto con estos) estén altamente conservados evolutivamente . [56] Sin embargo, existen ejemplos de evolución divergente en tríadas catalíticas, tanto en la reacción catalizada como en los residuos utilizados en la catálisis. La tríada sigue siendo el núcleo del sitio activo, pero está adaptada evolutivamente para cumplir diferentes funciones. [57] [58] Algunas proteínas, llamadas pseudoenzimas , tienen funciones no catalíticas (por ejemplo, regulación mediante unión inhibidora) y han acumulado mutaciones que inactivan su tríada catalítica. [59]
Las tríadas catalíticas realizan catálisis covalente a través de un intermedio acil-enzima. Si este intermedio se resuelve con agua, el resultado es la hidrólisis del sustrato. Sin embargo, si el intermediario se resuelve mediante el ataque de un segundo sustrato, entonces la enzima actúa como una transferasa . Por ejemplo, el ataque de un grupo acilo da como resultado una reacción de aciltransferasa . Varias familias de enzimas transferasas han evolucionado a partir de hidrolasas mediante adaptación para excluir el agua y favorecer el ataque de un segundo sustrato. [60] En diferentes miembros de la superfamilia de α/β-hidrolasa, la tríada Ser-His-Asp se sintoniza mediante residuos circundantes para realizar al menos 17 reacciones diferentes. [35] [61] Algunas de estas reacciones también se logran con mecanismos que han alterado la formación o la resolución del intermedio acil-enzima, o que no proceden a través de un intermedio acil-enzima. [35]
Además, la amidofosforribosiltransferasa , que tiene dos sitios activos, ha desarrollado un mecanismo de transferasa alternativo . [l] En el primer sitio activo, una tríada de cisteína hidroliza un sustrato de glutamina para liberar amoníaco libre. Luego, el amoníaco se difunde a través de un túnel interno en la enzima hasta el segundo sitio activo, donde se transfiere a un segundo sustrato. [62] [63]
La evolución divergente de los residuos del sitio activo es lenta debido a fuertes limitaciones químicas. Sin embargo, algunas superfamilias de proteasas han evolucionado de un nucleófilo a otro. Esto se puede inferir cuando una superfamilia (con el mismo pliegue ) contiene familias que utilizan diferentes nucleófilos. [49] Estos cambios de nucleófilos han ocurrido varias veces durante la historia evolutiva, sin embargo, los mecanismos por los cuales esto sucede aún no están claros. [17] [49]
Dentro de las superfamilias de proteasas que contienen una mezcla de nucleófilos (por ejemplo, el clan PA ), las familias se designan por su nucleófilo catalítico (C=cisteína proteasas, S=serina proteasas).
Otra subclase de variantes de tríadas catalíticas son las pseudoenzimas , que tienen mutaciones de tríadas que las hacen catalíticamente inactivas, pero capaces de funcionar como proteínas estructurales o de unión. [65] [66] Por ejemplo, la proteína de unión a heparina Azurocidina es un miembro del clan PA, pero con una glicina en lugar del nucleófilo y una serina en lugar de histidina. [67] De manera similar, RHBDF1 es un homólogo de las proteasas romboides de la familia S54 con una alanina en lugar de la serina nucleofílica. [68] [69] En algunos casos, las pseudoenzimas aún pueden tener una tríada catalítica intacta, pero las mutaciones en el resto de la proteína eliminan la actividad catalítica. El clan CA contiene miembros catalíticamente inactivos con tríadas mutadas ( la calpamodulina tiene lisina en lugar de su nucleófilo cisteína) y con tríadas intactas pero mutaciones inactivadoras en otros lugares (la testina de rata conserva una tríada Cys-His-Asn). [70]
La enzimología de las proteasas proporciona algunos de los ejemplos más claros conocidos de evolución convergente. La misma disposición geométrica de los residuos de la tríada ocurre en más de 20 superfamilias de enzimas separadas . Cada una de estas superfamilias es el resultado de una evolución convergente para la misma disposición de tríada dentro de un pliegue estructural diferente . Esto se debe a que existen formas productivas limitadas para organizar los tres residuos de la tríada, la cadena principal de la enzima y el sustrato. Estos ejemplos reflejan las limitaciones físicas y químicas intrínsecas de las enzimas, lo que lleva a la evolución a converger repetida e independientemente en soluciones equivalentes. [1] [2]
Las serina proteasas, como las superfamilias de quimotripsina [e] y subtilisina , convergieron en las mismas geometrías de tríada. Se ha producido una evolución convergente similar con las cisteína proteasas como las superfamilias de proteasa C3 viral y papaína [c] . Estas tríadas han convergido casi en la misma disposición debido a las similitudes mecanísticas en los mecanismos de proteólisis de cisteína y serina. [2]
Familias de cisteína proteasas
Familias de serina proteasas
Las treonina proteasas utilizan el aminoácido treonina como nucleófilo catalítico. A diferencia de la cisteína y la serina, la treonina es un hidroxilo secundario (es decir, tiene un grupo metilo). Este grupo metilo restringe en gran medida las posibles orientaciones de la tríada y el sustrato, ya que el metilo choca con la cadena principal de la enzima o con la base de histidina. [2] Cuando el nucleófilo de una serina proteasa se mutó a treonina, el metilo ocupó una mezcla de posiciones, la mayoría de las cuales impidieron la unión del sustrato. [71] En consecuencia, el residuo catalítico de una treonina proteasa se encuentra en su extremo N. [2]
Se sabe que dos superfamilias de enzimas evolutivamente independientes con diferentes pliegues proteicos utilizan el residuo N -terminal como nucleófilo: la superfamilia PB (proteosomas que utilizan el pliegue Ntn) [32] y la superfamilia PE ( acetiltransferasas que utilizan el pliegue DOM) [33] . La estructura del sitio activo en pliegues proteicos completamente diferentes indica que el sitio activo evolucionó de manera convergente en esas superfamilias. [2] [26]
Familias de treonina proteasas
