nucleoide

Región dentro de una célula procariótica que contiene material genético.

El nucleoide (que significa similar a un núcleo ) es una región de forma irregular dentro de la célula procariótica que contiene todo o la mayor parte del material genético . ^{[1] [2] [3]} El cromosoma de un procariota típico es circular y su longitud es muy grande en comparación con las dimensiones de la célula, por lo que es necesario compactarlo para que quepa. A diferencia del núcleo de una célula eucariota , no está rodeado por una membrana nuclear . En cambio, el nucleoide se forma por condensación y disposición funcional con la ayuda de proteínas arquitectónicas cromosómicas y moléculas de ARN , así como por superenrollamiento del ADN . La longitud de un genoma varía ampliamente (generalmente al menos unos pocos millones de pares de bases) y una célula puede contener múltiples copias del mismo.

Aún no se conoce una estructura de alta resolución de un nucleoide bacteriano; sin embargo, se han investigado características clave en Escherichia coli como organismo modelo . En E. coli , el ADN cromosómico está, en promedio, superenrollado negativamente y plegado en bucles plectonémicos , que están confinados a diferentes regiones físicas y rara vez se difunden entre sí. Estos bucles se organizan espacialmente en regiones del tamaño de megabases llamadas macrodominios, dentro de las cuales los sitios de ADN interactúan con frecuencia, pero entre las cuales las interacciones son raras. El ADN condensado y organizado espacialmente forma un elipsoide helicoidal que está confinado radialmente en la célula. La estructura tridimensional del ADN en el nucleoide parece variar según las condiciones y está vinculada a la expresión genética , de modo que la arquitectura del nucleoide y la transcripción genética son estrechamente interdependientes y se influyen mutuamente de forma recíproca.

Formación del nucleoide A de Escherichia coli . Ilustración de una conformación abierta del genoma circular de Escherichia coli . Las flechas representan la replicación bidireccional del ADN. Se marcan la posición genética del origen de la replicación bidireccional del ADN ( oriC ) y el sitio de decatenación cromosómica ( dif ) en la región de terminación de la replicación ( ter ). Los colores representan segmentos específicos de ADN como se analiza en C. B. Una ilustración de una forma de espiral aleatoria adoptada por el ADN circular puro de Escherichia coli en equilibrio térmico sin superenrollamientos ni factores estabilizadores adicionales. ^{[4] [5]} C. Una caricatura del cromosoma de una célula de Escherichia coli recién nacida . El ADN genómico no sólo está condensado 1.000 veces en comparación con su forma de espiral aleatoria pura, sino que también está organizado espacialmente. oriC y dif están localizados en la mitad de la célula, y regiones específicas del ADN indicadas por colores en A se organizan en dominios espacialmente distintos. Se han identificado seis dominios espaciales en E. coli . Cuatro dominios (Ori, Ter, Izquierda y Derecha) están estructurados y dos (NS-derecha y NS-izquierda) no están estructurados. La forma condensada y organizada del ADN junto con sus proteínas y ARN asociados se llama nucleoide.

Fondo

En muchas bacterias, el cromosoma es una única molécula de ADN bicatenario covalentemente cerrada (circular) que codifica la información genética en forma haploide . El tamaño del ADN varía de 500.000 a varios millones de pares de bases (pb) y codifica de 500 a varios miles de genes, según el organismo. ^[2] El ADN cromosómico está presente en las células en una forma muy compacta y organizada llamada nucleoide (que significa similar a un núcleo ), que no está recubierto por una membrana nuclear como en las células eucariotas. ^[6] El nucleoide aislado contiene 80% de ADN, 10% de proteína y 10% de ARN en peso. ^{[7] [8]}

La bacteria gramnegativa Escherichia coli es un sistema modelo para la investigación de nucleoides sobre cómo el ADN cromosómico se convierte en nucleoide, los factores involucrados en él, lo que se sabe sobre su estructura y cómo algunos de los aspectos estructurales del ADN influyen en la expresión genética . ^{[2] [3]}

Hay dos aspectos esenciales de la formación de nucleoides; Condensación de un ADN grande en un espacio celular pequeño y organización funcional del ADN en forma tridimensional. El cromosoma circular haploide en E. coli consta de ~ 4,6 x 10 ⁶ pb. Si el ADN se relaja en la forma B , tendría una circunferencia de ~1,5 milímetros (0,332 nm x 4,6 x 10 ⁶ ). Sin embargo, una molécula de ADN grande, como el ADN cromosómico de E. coli , no permanece como una molécula rígida y recta en suspensión. ^[5] El movimiento browniano generará curvaturas y dobleces en el ADN. La longitud máxima hasta la cual un ADN de doble hélice permanece recto al resistir la flexión impuesta por el movimiento browniano es ~50 nm o 150 pb, lo que se denomina longitud de persistencia . Así, el ADN puro se condensa sustancialmente sin ningún factor adicional; en equilibrio térmico, asume una forma de bobina aleatoria . ^{[4] [5]} La bobina aleatoria de ADN cromosómico de E. coli ocuparía un volumen (4/3 π r ³ ) de ~ 523 µm ³ , calculado a partir del radio de giro ( R _g = (√N a)/√ 6) donde a es la longitud de Kuhn (2 x longitud de persistencia) y N es el número de segmentos de longitud de Kuhn en el ADN (longitud total del ADN dividida por a ). ^[5] Aunque el ADN ya está condensado en forma de espiral aleatoria, todavía no puede asumir el volumen del nucleoide, que es inferior a una micra. Por lo tanto, la propiedad inherente del ADN no es suficiente: factores adicionales deben ayudar a condensar aún más el ADN del orden de ~10 ³ (volumen de la bobina aleatoria dividido por el volumen del nucleoide). El segundo aspecto esencial de la formación de nucleoides es la disposición funcional del ADN. El ADN cromosómico no sólo está condensado sino también funcionalmente organizado de manera compatible con los procesos de transacción del ADN, como la replicación , la recombinación , la segregación y la transcripción . ^{[9] [10] [11]} Casi cinco décadas de investigación a partir de 1971, ^[7]ha demostrado que la forma final del nucleoide surge de una organización jerárquica del ADN. En la escala más pequeña (1 kb o menos), las proteínas arquitectónicas del ADN asociadas a nucleoides condensan y organizan el ADN doblando, formando bucles, formando puentes o envolviéndolo. A mayor escala (10 kb o más), el ADN forma bucles plectonémicos, una forma trenzada de ADN inducida por superenrollamiento. En la escala de megabase, los bucles plectonémicos se fusionan en seis dominios organizados espacialmente (macrodominios), que se definen por interacciones físicas más frecuentes entre sitios de ADN dentro del mismo macrodominio que entre diferentes macrodominios. ^[12] Las conexiones ADN-ADN de largo y corto alcance formadas dentro y entre los macrodominios contribuyen a la condensación y la organización funcional. Finalmente, el nucleoide es un elipsoide helicoidal con regiones de ADN muy condensado en el eje longitudinal. ^{[13] [14] [15]}

Condensación y organización

Nucleoide a escala ≥1 kb. Organización del ADN por proteínas asociadas a nucleoides. El ADN se representa como una línea gris recta o curva y las proteínas asociadas a nucleoides se representan como esferas azules.

Proteínas asociadas a nucleoides (NAP)

En los eucariotas, el ADN genómico se condensa en forma de una serie repetida de partículas de proteínas de ADN llamadas nucleosomas . ^{[16] [17] [18]}

Un nucleosoma consta de ~146 pb de ADN envuelto alrededor de un complejo octamérico de proteínas histonas . Aunque las bacterias no tienen histonas, poseen un grupo de proteínas de unión al ADN denominadas proteínas asociadas a nucleoides (NAP) que son funcionalmente análogas a las histonas en un sentido amplio. Las NAP son muy abundantes y constituyen una proporción significativa del componente proteico del nucleoide. ^[19]

Una característica distintiva de las NAP es su capacidad para unirse al ADN de una manera específica (ya sea de secuencia o de estructura) y no específica de secuencia. Como resultado, las NAP son proteínas de doble función. ^{[20] La unión específica de NAP está involucrada principalmente en} la transcripción , replicación , recombinación y reparación de genes específicos . ^{[9] [10] [11]} En el pico de su abundancia, el número de moléculas de muchas NAP es varios órdenes de magnitud mayor que el número de sitios de unión específicos en el genoma. ^[20] Por lo tanto, se razona que las NAP se unen al ADN cromosómico principalmente en el modo no específico de secuencia y es este modo el que es crucial para la compactación cromosómica. Es de destacar que la denominada unión no específica de secuencia de una NAP puede no ser completamente aleatoria. Podría haber una especificidad de secuencia baja o una especificidad estructural debido a la conformación del ADN dependiente de la secuencia o la conformación del ADN creada por otros NAP. ^[18]

Aunque los mecanismos moleculares de cómo las NAP condensan el ADN in vivo no se comprenden bien, según los extensos estudios in vitro parece que las NAP participan en la compactación cromosómica a través de los siguientes mecanismos: Las NAP inducen y estabilizan curvaturas en el ADN, por lo que ayudan en la condensación del ADN al reducir la duración de la persistencia. ^[20] Los NAP condensan el ADN mediante puentes, envolturas y agrupaciones que podrían ocurrir entre segmentos de ADN cercanos o segmentos de ADN distantes del cromosoma. Otro mecanismo por el cual los NAP participan en la compactación cromosómica es restringiendo los superenrollamientos negativos en el ADN, contribuyendo así a la organización topológica del cromosoma. ^[20]

Hay al menos 12 NAP identificados en E. coli, ^[20] los más estudiados son HU, IHF, H-NS y Fis. Su abundancia y propiedades de unión al ADN y su efecto sobre la condensación y organización del ADN se resumen en las tablas siguientes. ^[20]

¹ Se tomaron datos de abundancia (moléculas/célula); ^[21] El número entre paréntesis es la concentración micromolar calculada usando la siguiente fórmula: (número de unidades funcionales nativas/número de Avogadro) x (1/volumen celular en litro) x 10 ³ . El volumen celular en litros (2 x 10 ⁻¹⁵ ) se determinó suponiendo que el volumen de la célula de E. coli era 2 μm ³ . ^[21]

¹ La afinidad de unión se refiere a la constante de disociación en equilibrio (Kd) en unidades molares (M). ND = no determinado

HU

La proteína similar a las histonas de la cepa U93 (HU) de E. coli es una proteína conservada evolutivamente en las bacterias. ^{[33] [34]} HU existe en E. coli como homodímeros y heterodímeros de dos subunidades HUα y HUβ que comparten un 69% de identidad de aminoácidos. ^[35] Aunque se la conoce como una proteína similar a las histonas, los parientes funcionales cercanos de HU en eucariotas son proteínas del grupo de alta movilidad (HMG), y no histonas. ^{[36] [37]} HU es una proteína de unión al ADN no específica de secuencia. Se une con baja afinidad a cualquier ADN lineal. Sin embargo, se une preferentemente con alta afinidad a un ADN estructuralmente distorsionado. ^{[38] [39] [40] [41] [42] [24]} Los ejemplos de sustratos de ADN distorsionados incluyen ADN cruciforme , ADN abultado, ADN ds que contiene una rotura monocatenaria como muescas , espacios o bifurcaciones . Además, HU se une y estabiliza específicamente un bucle de ADN mediado por proteínas. ^[43] En el modo de unión al ADN estructuralmente específico, HU reconoce un motivo estructural común definido por curvaturas o torceduras creadas por distorsión, ^{[22] [44] [23]} mientras que se une a un ADN lineal bloqueando la columna vertebral de fosfato. ^[45] Si bien la unión estructuralmente específica de alta afinidad es necesaria para funciones especializadas de HU, como la recombinación específica de sitio , la reparación del ADN , el inicio de la replicación del ADN y la regulación genética, ^{[9] [10] [11]} parece que la La unión general de baja afinidad está implicada en la condensación del ADN. ^[45] En la inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de ADN ( ChIP-Seq ), HU no revela ningún evento de unión específico. ^[46] En cambio, muestra una unión uniforme en todo el genoma, lo que presumiblemente refleja su unión en su mayoría débil y no específica de secuencia, enmascarando así la unión de alta afinidad in vivo . ^[46]

En las cepas que carecen de HU, el nucleoide se "descondensa", lo que coincide con el papel de HU en la compactación del ADN. ^[47] Los siguientes estudios in vitro sugieren posibles mecanismos de cómo HU podría condensar y organizar el ADN in vivo . HU no solo se une de manera estable al ADN distorsionado con curvaturas, sino que también induce curvaturas flexibles incluso en un ADN lineal a una concentración inferior a 100 nM. Por el contrario, HU muestra el efecto arquitectónico opuesto sobre el ADN en concentraciones fisiológicamente relevantes más altas. ^{[45] [9] [10] [11] [47] [48]} Forma filamentos rígidos de nucleoproteínas que provocan el estiramiento del ADN y no su flexión. Los filamentos pueden formar además una red de ADN (Agrupación de ADN) expandible tanto lateral como medialmente debido a la multimerización HU-HU provocada por la unión de ADN no específica de secuencia. ^[45]

¿Cómo son relevantes estos comportamientos de HU dentro de la célula? La formación de filamentos requiere una unión de alta densidad de HU al ADN, un dímero de HU por ADN de 9 a 20 pb. Pero sólo hay un dímero de HU cada ~150 pb del ADN cromosómico según la abundancia estimada de 30.000 dímeros de HU por célula (4.600.000 pb/30.000). ^[21] Esto indica que es más probable que las curvaturas flexibles ocurran in vivo . La flexión flexible provocaría condensación debido a una reducción en la longitud de persistencia del ADN, como lo demuestran los experimentos con pinzas magnéticas , que permiten estudiar la condensación de una sola molécula de ADN por una proteína de unión al ADN. ^{[48] ​​[49]} Sin embargo, debido a la cooperatividad , los filamentos rígidos y las redes podrían formarse en algunas regiones del cromosoma. La formación de filamentos por sí sola no induce la condensación, ^[48] pero la formación de redes o agrupaciones de ADN puede contribuir sustancialmente a la condensación al unir segmentos cromosómicos distantes o cercanos. ^[45]

"Ocupación de todo el genoma de proteínas asociadas a nucleoides de E. coli ". "Un diseño circular del genoma de E. coli que muestra la ocupación de todo el genoma de NAP Fis, H-NS, HU e IHF en las fases de crecimiento y estacionarias en E. coli ". Los gráficos de histograma de la ocupación del genoma de NAP determinados por inmunoprecipitación de cromatina junto con secuenciación de ADN (ChIP-seq) se muestran fuera del genoma circular. El tamaño del contenedor de los histogramas es de 300 pb. Figura preparada en circos/0.69-6 utilizando los datos de ChIP-Seq de. ^{[46] [50]}

FIH

El factor de integración del huésped (IHF) es estructuralmente casi idéntico al HU ^[51] pero se comporta de manera diferente al HU en muchos aspectos. A diferencia de HU, que se une preferentemente a un motivo estructural independientemente de la secuencia, IHF se une preferentemente a una secuencia de ADN específica aunque la especificidad surge a través de la estructura y deformabilidad del ADN dependiente de la secuencia. La unión específica de IHF en sitios afines dobla bruscamente el ADN en >160 grados. ^[51] Una aparición del motivo de secuencia afín es aproximadamente 3000 en el genoma de E. coli . ^[46] La abundancia estimada de IHF en la fase de crecimiento es de aproximadamente 6000 dímeros por célula. Suponiendo que un dímero de IHF se une a un solo motivo y que el nucleoide contiene más de un equivalente genómico durante la fase de crecimiento exponencial, la mayoría de las moléculas de IHF ocuparían sitios específicos en el genoma y probablemente solo condensarían el ADN al inducir una curvatura pronunciada. ^[46]

Además de la unión preferencial a una secuencia de ADN específica, IHF también se une al ADN de una manera no específica de secuencia con afinidades similares a HU. El papel de la unión no específica de IHF en la condensación del ADN parece ser crítico en la fase estacionaria porque la abundancia de IHF aumenta cinco veces en la fase estacionaria y los dímeros de IHF adicionales probablemente se unirían al ADN cromosómico de manera no específica. ^{[21] [52] [53]} A diferencia del HU, el IHF no forma filamentos rígidos gruesos en concentraciones más altas. En cambio, su unión no específica también induce la flexión del ADN, aunque el grado de flexión es mucho menor que el de sitios específicos y es similar a la flexión flexible inducida por HU en un ADN lineal en bajas concentraciones. ^[54] In vitro , la flexión inducida por la unión no específica de IHF puede provocar la condensación del ADN y promueve la formación de complejos de nucleoproteínas de orden superior dependiendo de las concentraciones de cloruro de potasio y cloruro de magnesio. ^[54] La organización del ADN de orden superior por IHF in vivo aún no está clara. ^[54]

H-NS

Una característica distinguible de la proteína estructurante nucleoide (H-NS) similar a histonas o termoestable ^{[55] [56] [57] [58]} de otras NAP es la capacidad de cambiar de la forma homodimérica en concentraciones relativamente bajas (<1 x 10 ⁻⁵ M) a un estado oligomérico en niveles más altos. ^{[59] [60]} Debido a las propiedades de oligomerización, H-NS se propaga lateralmente a lo largo del ADN rico en AT en una reacción de nucleación , donde los sitios de alta afinidad funcionan como centros de nucleación. ^{[61] [62] [28]} La propagación de H-NS en el ADN produce dos resultados opuestos dependiendo de la concentración de magnesio en la reacción. A bajas concentraciones de magnesio (<2 mM), H-NS forma filamentos de nucleoproteínas rígidos, mientras que forma puentes inter e intramoleculares a concentraciones más altas de magnesio (>5 mM). ^{[63] [64] [65] [66] [67]} La ​​formación de filamentos rígidos da como resultado el enderezamiento del ADN sin condensación, mientras que la formación de puentes provoca un plegamiento sustancial del ADN. ^[66] El análisis de la unión de H-NS en el genoma mediante ensayos ChIP-Seq proporcionó evidencia indirecta de la propagación de H-NS en el ADN in vivo . H-NS se une selectivamente a 458 regiones del genoma. ^[50] Aunque se ha demostrado que H-NS prefiere el ADN curvo formado por pistas A repetidas en secuencias de ADN ^{[61] [68],} la base de la unión selectiva es la presencia de un motivo de secuencia conservado que se encuentra en regiones ricas en AT. ^[27] Más importante aún, la aparición frecuente del motivo de secuencia dentro de una región de unión H-NS que puede reforzar las interacciones cooperativas proteína-proteína, y la longitud inusualmente larga de la región de unión son consistentes con la propagación de la proteína. Si la formación de filamentos o los puentes de ADN prevalecen in vivo depende de la concentración fisiológica de magnesio dentro de la célula. ^{[66] [69]} Si la concentración de magnesio es uniformemente baja (<5 mM), H-NS formaría filamentos rígidos de nucleoproteínas in vivo . ^[66] Alternativamente, si hay una distribución desigual de magnesio en la célula, podría promover tanto la unión como el endurecimiento del ADN, pero en diferentes regiones del nucleoide. ^[66]

Además, H-NS es mejor conocido como un silenciador genético global que inhibe preferentemente la transcripción de genes transferidos horizontalmente y es el filamento rígido el que conduce al silenciamiento genético. ^{[70] [71]} En conjunto, parece que la formación de filamentos rígidos es el resultado más probable de las interacciones H-NS-ADN in vivo que conducen al silenciamiento de genes pero no inducen la condensación del ADN. Consistentemente, la ausencia de H-NS no cambia el volumen del nucleoide. ^[72] Sin embargo, es posible que E. coli experimente una alta concentración de magnesio en algunas condiciones ambientales. En tales condiciones, H-NS puede cambiar de su forma inductora de filamento a la forma inductora de puente que contribuye a la condensación y organización del ADN. ^[66]

Fis

El factor de estimulación de la inversión (Fis) es una proteína de unión al ADN de secuencia específica que se une a secuencias de ADN específicas que contienen un motivo simétrico de 15 pb. ^{[29] [30] [73]} Al igual que IHF, Fis induce la flexión del ADN en sitios afines. La capacidad de doblar el ADN es evidente en la estructura del homodímero de Fis. Un homodímero de Fis posee dos motivos hélice-vuelta-hélice (HTH), uno de cada monómero. Un motivo HTH normalmente reconoce el surco principal del ADN. Sin embargo, la distancia entre las hélices de reconocimiento de ADN de los dos motivos HTH en el homodímero Fis es de 25 Å , es decir, ~8 Å más corta que el paso de un ADN-B canónico , lo que indica que la proteína debe doblar o torcer el ADN para unirse de manera estable. . ^{[74] [75]} Consistentemente, la estructura cristalina de los complejos Fis-ADN muestra que la distancia entre las hélices de reconocimiento permanece sin cambios, mientras que el ADN se curva en el rango de 60 a 75 grados. ^[30] Hay 1464 regiones de unión a Fis distribuidas en todo el genoma de E. coli y un motivo de unión, identificado computacionalmente, coincide con el motivo conocido de 15 pb. ^{[50] [76]} La unión específica de Fis en dichos sitios induciría curvaturas en el ADN y, por lo tanto, contribuiría a la condensación del ADN al reducir la longitud de persistencia del ADN. Además, muchos sitios de unión de Fis se producen en tándem, como los de los promotores de ARN estables, por ejemplo, el promotor P1 del operón de ARNr rrnB . Es probable que la flexión coherente de Fis en los sitios en tándem cree un microbucle de ADN que puede contribuir aún más a la condensación del ADN. ^[77]

Además de la unión específica de alta afinidad a sitios afines, Fis puede unirse a una secuencia de ADN aleatoria. La unión no específica al ADN es importante porque Fis es tan abundante como HU en la fase de crecimiento . Por lo tanto, se espera que la mayoría de las moléculas de Fis se unan al ADN de una manera no específica de secuencia. Los experimentos con pinzas magnéticas muestran que esta unión no específica de Fis puede contribuir a la condensación y organización del ADN. ^{[78] [79]} Fis provoca una condensación leve de una sola molécula de ADN a <1 mM, pero induce un plegamiento sustancial mediante la formación de bucles de ADN de un tamaño promedio de ~800 pb a >1 mM. Los bucles en los experimentos con pinzas magnéticas son distintos de los microbucles creados por la flexión coherente del ADN en sitios afines, ya que requieren la formación de complejos de ADN-proteína de alta densidad logrados mediante unión independiente de la secuencia. Aunque aún no se ha demostrado la aparición de tales bucles in vivo , la unión de alta densidad de Fis puede ocurrir in vivo mediante la acción concertada de unión tanto específica como no específica. La aparición en tándem de sitios específicos podría iniciar una reacción de nucleación similar a la de H-NS, y luego la unión no específica conduciría a la formación de matrices de Fis localizadas de alta densidad. El puente entre estas regiones localizadas puede crear grandes bucles de ADN. ^[79] Fis está presente exclusivamente en la fase de crecimiento y no en la fase estacionaria . ^{[80] [81]} Por lo tanto, cualquier papel en la condensación cromosómica por parte de Fis debe ser específico de las células en crecimiento. ^[81]

ARN asociados a nucleoides (naRNA)

Los primeros estudios que examinaron el efecto del tratamiento con ARNasa A en nucleoides aislados indicaron que el ARN participaba en la estabilización del nucleoide en estado condensado. ^[82] Además, el tratamiento con ARNasa A rompió las fibras de ADN en fibras más delgadas, como se observó mediante una microscopía de fuerza atómica del nucleoide utilizando el "procedimiento de lisis en sustrato". ^[83] Estos hallazgos demostraron la participación del ARN en la estructura nucleoide, pero la identidad de las moléculas de ARN permaneció desconocida hasta hace poco. ^[47] La ​​mayoría de los estudios sobre HU se centraron en su unión al ADN. ^[83] Sin embargo, HU también se une a híbridos de ARNbc y ADN-ADN con una afinidad más baja similar a la de un ADNbc lineal. ^[84] Además, HU se une preferentemente a estructuras secundarias que contienen ARN y a un híbrido de ARN-ADN en el que el ARN contiene una mella o saliente. ^{[84] [85]} Las afinidades de unión de HU con estos sustratos de ARN son similares a aquellas con las que se une al ADN distorsionado. Una inmunoprecipitación de ARN unido a HU junto con un estudio de microarrays y transcripción inversa (RIP-Chip), así como un análisis de ARN de nucleoides intactos purificados, identificaron moléculas de ARN asociadas a nucleoides que interactúan con HU. ^[47] Varios de ellos son ARN no codificantes, y uno de esos ARN, llamado naRNA4 (ARN 4 asociado a nucleoides), está codificado en un palíndromo extragénico repetitivo ( REP325 ). En una cepa que carece de REP325 , el nucleoide se descondensa como en una cepa que carece de HU. ^[47] Lo más probable es que naRNA4 participe en la condensación del ADN conectando segmentos de ADN en presencia de HU. ^[86] Estudios recientes proporcionan información sobre el mecanismo molecular de cómo naRNA4 establece conexiones ADN-ADN. El ARN se dirige a regiones del ADN que contienen estructuras cruciformes y forma un complejo ARN-ADN que es fundamental para establecer conexiones ADN-ADN. ^[87] Sorprendentemente, aunque HU ayuda en la formación del complejo, no está presente en el complejo final, lo que indica su papel potencial como catalizador (chaperona). La naturaleza del complejo ARN-ADN sigue siendo desconcertante porque la formación del complejo no implica un emparejamiento extenso de bases Watson/Crick pero es sensible a la RNasa H, que escinde el ARN en un híbrido ARN-ADN y el complejo se une a un anticuerpo específico para Híbridos ARN-ADN. ^{[47] [83] [84]}

superenrollamiento

Superenrollamiento del ADN A. Un ADN bicatenario lineal se convierte en una molécula topológicamente limitada si los dos extremos se unen covalentemente, formando un círculo. Las reglas de la topología del ADN se explican utilizando una molécula de este tipo (ccc-DNA) en la que un parámetro numérico llamado número de enlace (Lk) define la topología. Lk es una suma matemática de dos parámetros geométricos, torsión (Tw) y contorsión (Wr). Una torsión es el cruce de dos hebras y una torsión es un enrollamiento de la doble hélice del ADN sobre su eje que requiere doblarse. Lk es siempre un número entero y permanece invariante sin importar cuánto se deformen las dos hebras. Sólo se puede cambiar introduciendo una rotura en una o ambas cadenas de ADN mediante enzimas metabólicas del ADN llamadas topoisomerasas. B. Una tensión torsional creada por un cambio en Lk de un ADN relajado y topológicamente restringido se manifiesta en forma de superenrollamiento del ADN. Una disminución de Lk (Lk<Lk ₀ ) induce un superenrollamiento negativo mientras que un aumento de Lk (Lk>Lk ₀ ) induce un superenrollamiento positivo. Aquí sólo se representa el superenrollamiento negativo. Por ejemplo, si se introduce un corte en un ADN ccc y se eliminan cuatro vueltas antes de volver a unir las dos hebras, el ADN se superenrolla negativamente con una disminución en el número de vueltas o contorsiones, o ambas. Writhe puede adoptar dos tipos de estructuras geométricas llamadas plectonema y toroide. Los plectonemas se caracterizan por el entrelazamiento de la doble hélice del ADN y un bucle apical, mientras que el enrollamiento en espiral de la doble hélice del ADN alrededor de un eje forma toroides.

Debido a su estructura helicoidal , una molécula de ADN de doble hebra queda topológicamente restringida en una forma circular cerrada covalentemente que elimina la rotación de los extremos libres. ^[88] El número de veces que las dos hebras se cruzan en un ADN topológicamente restringido se denomina número de enlace (Lk), que equivale al número de vueltas helicoidales o giros en una molécula circular. ^[89] La Lk de un ADN topológico permanece invariante, no importa cómo se deforme la molécula de ADN, siempre que ninguna de las hebras esté rota. ^{[90] [91]}

La Lk del ADN en forma relajada se define como Lk ₀ . Para cualquier ADN, Lk ₀ se puede calcular dividiendo la longitud (en pb) del ADN por el número de pb por vuelta helicoidal. Esto equivale a 10,4 pb para el ADN en forma B relajado . Cualquier desviación de Lk ₀ provoca un superenrollamiento en el ADN. Una disminución en el número de enlace (Lk<Lk ₀ ) crea un superenrollamiento negativo, mientras que un aumento en el número de enlace (Lk>Lk ₀ ) crea un superenrollamiento positivo. ^{[92] [90]}

El estado superenrollado (cuando Lk no es igual a Lk ₀ ) da como resultado una transición en la estructura del ADN que puede manifestarse como un cambio en el número de giros (negativo <10,4 pb/vuelta, positivo >10,4 pb por vuelta) y/o en la formación de retorcimientos , llamados superenrollamientos. Por lo tanto, Lk se define matemáticamente como una suma dependiente del signo de los dos parámetros geométricos, torsión y contorsión. Una medida cuantitativa del superenrollamiento que es independiente del tamaño de las moléculas de ADN es la densidad de superenrollamiento (σ) donde σ =∆Lk/Lk ₀ . ^[91]

Las contorsiones pueden adoptar dos estructuras; plectonema y solenoide o toroide. Una estructura plectonémica surge del entrelazado del eje helicoidal. Las superenrollamientos toroidales se originan cuando el ADN forma varias espirales, alrededor de un eje y que no se cruzan entre sí, como las de un cable telefónico. ^[90] Las contorsiones en la forma de plectonemas son diestras y zurdas en ADN superenrollado positiva o negativamente, respectivamente. La lateralidad de las superenrollamientos toroidales es opuesta a la de los plectonemas. Tanto los plectonemas como las superenrollamientos toroidales pueden estar en forma libre o restringidos en forma unida con proteínas. El mejor ejemplo de superenrollamiento toroidal ligado en biología es el nucleosoma eucariota en el que el ADN se envuelve alrededor de histonas . ^[17]

Superenrollamientos plectonémicos en E. coli

Unidades básicas de organización genómica en bacterias y eucariotas. El ADN genómico, representado como una línea gris, está superenrollado negativamente tanto en bacterias como en eucariotas. Sin embargo, el ADN superenrollado negativamente está organizado en forma plectonémica en las bacterias, mientras que en los eucariotas está organizado en forma toroidal. Las proteínas asociadas a nucleoides (NAP), que se muestran como esferas coloreadas, restringen la mitad de las superenrollamientos plectonémicos, mientras que casi todas las superenrollamientos toroidales son inducidas y restringidas por nucleosomas (de color naranja), formados al envolver ADN alrededor de histonas.

En la mayoría de las bacterias, el ADN está presente en forma superenrollada. La naturaleza circular del cromosoma de E. coli lo convierte en una molécula topológicamente restringida que está en su mayor parte superenrollada negativamente con una densidad de superenrollamiento promedio estimada (σ) de -0,05. ^{[93] En la} cromatina eucariota , el ADN se encuentra principalmente en la forma toroidal que está restringida y definida por histonas mediante la formación de nucleosomas. Por el contrario, en el nucleoide de E. coli , aproximadamente la mitad del ADN cromosómico está organizado en forma de superenrollamientos plectonémicos libres. ^{[94] [95] [96]} El ADN restante está restringido en la forma plectonémica o en formas alternativas, incluida, entre otras, la forma toroidal, mediante la interacción con proteínas como las NAP. Por tanto, los superenrollamientos plectonémicos representan un superenrollamiento eficaz del genoma de E. coli que es responsable de su condensación y organización. Tanto el superenrollamiento plectonémico como el toroidal ayudan en la condensación del ADN. Es de destacar que debido a la ramificación de las estructuras plectonémicas, proporciona menos condensación de ADN que la estructura toroidal. Una molécula de ADN del mismo tamaño con iguales densidades de superenrollamiento es más compacta en forma toroidal que en forma plectonémica. Además de condensar el ADN, el superenrollamiento ayuda en la organización del ADN. Promueve el desenredo del ADN al reducir la probabilidad de catenación. ^[97] El superenrollamiento también ayuda a acercar dos sitios distantes de ADN, promoviendo así una posible interacción funcional entre diferentes segmentos de ADN. ^[91]

Fuentes de superenrollamiento en E. coli

Tres factores contribuyen a generar y mantener el superenrollamiento del ADN cromosómico en E. coli : (i) actividades de las topoisomerasas , (ii) el acto de transcripción y (iii) NAP. ^[95]

topoisomerasas

Las topoisomerasas son una categoría particular de enzimas metabólicas del ADN que crean o eliminan superenrollamientos rompiendo y luego volviendo a unir las cadenas de ADN. ^[98] E. coli posee cuatro topoisomerasas. La ADN girasa introduce un superenrollamiento negativo en presencia de ATP y elimina un superenrollamiento positivo en ausencia de ATP. ^[99] En todas las formas de vida, la ADN girasa es la única topoisomerasa que puede crear superenrollamientos negativos y es debido a esta capacidad única que los genomas bacterianos poseen superenrollamientos negativos libres; La ADN girasa se encuentra en todas las bacterias, pero está ausente en los eucariotas superiores. Por el contrario, Topo I se opone a la ADN girasa relajando el ADN superenrollado negativamente. ^{[100] [101]} Existe evidencia genética que sugiere que un equilibrio entre las actividades opuestas de la ADN girasa y Topo I es responsable de mantener un nivel estable de superhelicidad negativa promedio en E. coli . ^{[100] [102]} Ambas enzimas son esenciales para la supervivencia de E. coli . Una cepa nula de topA , el gen que codifica Topo I, sobrevive sólo debido a la presencia de mutaciones supresoras en los genes que codifican la ADN girasa. ^{[100] [102]} Estas mutaciones dan como resultado una actividad reducida de la girasa, lo que sugiere que el exceso de superenrollamiento negativo debido a la ausencia de Topo I se compensa con una actividad reducida del superenrollamiento negativo de la ADN girasa. Topo III es prescindible en E. coli y no se sabe que tenga ningún papel en el superenrollamiento en E. coli. ^[103] La función principal de Topo IV es resolver los cromosomas hermanos. Sin embargo, se ha demostrado que también contribuye al nivel de superenrollamiento negativo en estado estacionario al relajar el superenrollamiento negativo junto con Topo I. ^{[104] [105]}

Transcripción

Un modelo de dominio de superenrollamiento gemelo propuesto por Liu y Wang argumentó que el desenrollamiento de la doble hélice del ADN durante la transcripción induce el superenrollamiento en el ADN como se muestra en. ^[106] Según su modelo, la transcripción de la ARN polimerasa (RNAP) que se desliza a lo largo del ADN obliga al ADN a rotar. su eje helicoidal. Podría surgir un obstáculo en la libre rotación del ADN debido a una restricción topológica, lo que provocaría que el ADN delante de RNAP se tuerza demasiado (superenrollado positivamente) y el ADN detrás de RNAP se tuerza insuficientemente (superenrollado negativamente). Se ha descubierto que no se necesita una restricción topológica porque RNAP genera suficiente torque que provoca un superenrollamiento incluso en una plantilla de ADN lineal. ^[107] Si el ADN ya está superenrollado negativamente, esta acción relaja los superenrollamientos negativos existentes antes de causar una acumulación de superenrollamientos positivos delante de RNAP e introduce más superenrollamientos negativos detrás de RNAP. En principio, la ADN girasa y la Topo I deberían eliminar el exceso de superenrollamientos positivos y negativos respectivamente, pero si la tasa de elongación de RNAP excede el recambio de las dos enzimas, la transcripción contribuye al nivel de superenrollamiento en estado estacionario. ^[107]

Modelo de dominio de superenrollamiento gemelo para superenrollamiento inducido por transcripción A. Un ejemplo de ADN topológicamente restringido. Una barra gris representa una restricción topológica, por ejemplo, una proteína o un anclaje de membrana. B. La acomodación de la ARN polimerasa para el inicio de la transcripción da como resultado la apertura de la doble hélice del ADN. C. Un complejo de ARN polimerasa que se alarga no puede girar alrededor del eje helicoidal del ADN. Por lo tanto, la eliminación de vueltas helicoidales por la ARN polimerasa provoca un enrollamiento excesivo del ADN topológicamente restringido por delante y un enrollamiento insuficiente del ADN por detrás, generando ADN superenrollado positiva y negativamente, respectivamente. El superenrollamiento puede manifestarse como un cambio en el número de giros como se muestra en C o como una contorsión plectonémica como se muestra en D.

Control del superenrollamiento por NAP.

En la cromatina eucariota, el ADN rara vez está presente en forma superenrollada libre porque los nucleosomas restringen casi todos los superenrollamientos negativos mediante la estrecha unión del ADN a las histonas. De manera similar, en E. coli , los complejos de nucleoproteínas formados por NAP restringen la mitad de la densidad de superenrollamiento del nucleoide. ^{[93] [96]} En otras palabras, si una NAP se disocia de un complejo de nucleoproteína , el ADN adoptaría la forma plectonémica libre. Se ha demostrado experimentalmente que la unión al ADN de HU, Fis y H-NS restringe el superenrollamiento negativo en un ADN relajado pero topológicamente restringido. ^{[108] [109] [110] [111] [112]} Pueden hacerlo cambiando el paso helicoidal del ADN o generando contorsiones toroidales doblando y envolviendo el ADN. Alternativamente, las NAP pueden unirse preferentemente y estabilizar otras formas de ADN enrollado, como estructuras cruciformes y plectonemas ramificados. Se ha informado que Fis organiza plectonemas ramificados mediante su unión a regiones cruzadas y HU se une preferentemente a estructuras cruciformes. ^[112]

Los NAP también regulan indirectamente el superenrollamiento del ADN. Fis puede modular el superenrollamiento reprimiendo la transcripción de los genes que codifican la ADN girasa. ^[113] Existe evidencia genética que sugiere que HU controla los niveles de superenrollamiento estimulando la ADN girasa y reduciendo la actividad de Topo I. ^{[114] [115]} En apoyo de los estudios genéticos, se demostró que HU estimula la decatenación catalizada por ADN girasa de ADN in vitro . ^[116] No está claro mecánicamente cómo modula HU las actividades de la girasa y Topo I. HU podría interactuar físicamente con la ADN girasa y Topo I o las actividades de organización del ADN de HU, como la flexión del ADN, pueden facilitar o inhibir la acción de la ADN girasa y Topo. Yo respectivamente. ^{[114] [116]}

Los superenrollamientos plectonémicos se organizan en múltiples dominios topológicos

Una de las características sorprendentes del nucleoide es que los superenrollamientos plectonémicos están organizados en múltiples dominios topológicos. ^[117] En otras palabras, un solo corte en un dominio solo relajará ese dominio y no los demás. Se forma un dominio topológico debido a una barrera de difusión de superenrollamiento. Estudios independientes que emplean diferentes métodos han informado que los dominios topológicos tienen un tamaño variable que oscila entre 10 y 400 kb. ^{[95] [117] [118]} Una ubicación aleatoria de las barreras comúnmente observada en estos estudios parece explicar la amplia variabilidad en el tamaño de los dominios. ^[117]

Aunque aún no se han establecido las identidades de las barreras de dominio, los posibles mecanismos responsables de la formación de las barreras incluyen: (i) Una barrera de dominio podría formarse cuando una proteína con capacidad para restringir superenrollamientos se une simultáneamente a dos sitios distintos en el cromosoma formando una barrera topológicamente bucle o dominio de ADN aislado. Se ha demostrado experimentalmente que los bucles mediados por proteínas en el ADN superenrollado pueden crear un dominio topológico. ^{[119] [120]} Los NAP como H-NS y Fis son candidatos potenciales, según sus capacidades de bucle de ADN y la distribución de sus sitios de unión. (ii) Los elementos de mosaico intercalados bacterianos (BIME) también aparecen como candidatos potenciales para barreras de dominio. Los BIME son secuencias de repeticiones palindrómicas que generalmente se encuentran entre genes. Se ha demostrado que un BIME impide la difusión del superenrollamiento en un casete topológico diseñado sintéticamente insertado en el cromosoma de E. coli . ^[121] Hay ~600 BIME distribuidos en todo el genoma, posiblemente dividiendo el cromosoma en 600 dominios topológicos. ^[122] (iii) Las barreras también podrían resultar de la unión del ADN a la membrana celular a través de una proteína que se une tanto al ADN como a la membrana o mediante la transcripción incipiente y la traducción de proteínas ancladas a la membrana. (iv) La actividad de transcripción puede generar barreras de difusión de superenrollamiento. Se ha demostrado que una RNAP que transcribe activamente bloquea la disipación de superenrollamientos plectonémicos, formando así una barrera de difusión de superenrollamiento. ^{[123] [124] [125]}

El ADN cromosómico dentro del nucleoide se segrega en dominios topológicos superenrollados independientes A. Ilustración de un dominio topológico único de un ADN superenrollado. Un único corte bicatenario en cualquier lugar sería suficiente para relajar la tensión de superenrollamiento de todo el dominio. B. Una ilustración de múltiples dominios topológicos en una molécula de ADN superenrollada. La presencia de barreras de difusión superenrolladas segrega una molécula de ADN superenrollada en múltiples dominios topológicos. Las barreras de difusión hipotéticas superenrolladas se representan como esferas verdes. Como resultado, un único corte bicatenario sólo relajará un dominio topológico y no los demás. Los superenrollamientos plectonémicos de ADN dentro del nucleoide de E. coli están organizados en varios dominios topológicos, pero por simplicidad solo se muestran cuatro dominios con un número diferente de superenrollamientos.

Dinámica de nucleoides dependiente de la fase de crecimiento.

El nucleoide se reorganiza en las células en fase estacionaria, lo que sugiere que la estructura del nucleoide es altamente dinámica, determinada por el estado fisiológico de las células. Una comparación de mapas de contactos de alta resolución del nucleoide reveló que los contactos de largo alcance en el macrodominio Ter aumentaron en la fase estacionaria , en comparación con la fase de crecimiento . ^[126] Además, los límites del CID en la fase estacionaria fueron diferentes de los encontrados en la fase de crecimiento. Finalmente, la morfología de los nucleoides sufre una transformación masiva durante la fase estacionaria prolongada; ^[127] el nucleoide exhibe estructuras toroidales ordenadas. ^[128]

Los cambios específicos de la fase de crecimiento en la estructura de los nucleoides podrían deberse a un cambio en los niveles de las proteínas arquitectónicas del ADN asociadas a los nucleoides (las subunidades NAP y Muk), el superenrollamiento y la actividad de transcripción. La abundancia de NAP y las subunidades Muk cambia según el ciclo de crecimiento bacteriano. Fis y la proteína de unión al ADN inducida por el hambre Dps, otra NAP, están presentes casi exclusivamente en la fase de crecimiento y en la fase estacionaria, respectivamente. Los niveles de Fis aumentan al entrar en la fase exponencial y luego disminuyen rápidamente mientras las células todavía están en la fase exponencial, alcanzando niveles que son indetectables en la fase estacionaria. ^[129] Mientras que los niveles de Fis comienzan a disminuir, los niveles de Dps comienzan a aumentar y alcanzan un máximo en la fase estacionaria. ^[21] Una transición dramática en la estructura nucleoide observada en la fase estacionaria prolongada se ha atribuido principalmente a Dps. Forma conjuntos de ADN/ cristalinos que actúan para proteger el nucleoide de los agentes que dañan el ADN presentes durante la inanición. ^[128]

HU, IHF y H-NS están presentes tanto en la fase de crecimiento como en la fase estacionaria. ^[21] Sin embargo, su abundancia cambia significativamente, de modo que HU y Fis son los NAP más abundantes en la fase de crecimiento, mientras que IHF y Dps se convierten en los NAP más abundantes en la fase estacionaria. ^[21] HUαα es la forma predominante en la fase exponencial temprana, mientras que la forma heterodimérica predomina en la fase estacionaria, con cantidades menores de homodímeros. ^[130] Esta transición tiene consecuencias funcionales con respecto a la estructura nucleoide, porque las dos formas parecen organizar y condensar el ADN de manera diferente; Tanto los homodímeros como los heterodímeros forman filamentos, pero solo el homodímero puede unir múltiples segmentos de ADN para formar una red de ADN. ^[45] El número de copias de MukB aumenta dos veces en la fase estacionaria. ^{[131] [132]} Un aumento en el número de moléculas de MukB podría tener influencia en la procesividad del complejo MukBEF como factor de extrusión de bucles de ADN, lo que resultaría en un número mayor o mayor de bucles. ^{[131] [132]}

El superenrollamiento puede actuar de manera concertada con las proteínas arquitectónicas del ADN para reorganizar el nucleoide. El nivel general de superenrollamiento disminuye en la fase estacionaria y el superenrollamiento muestra un patrón diferente a nivel regional. ^[133] Los cambios en el superenrollamiento pueden alterar la organización topológica del nucleoide. Además, debido a que una región cromosómica de alta actividad de transcripción forma un límite CID, los cambios en la actividad de transcripción durante diferentes fases de crecimiento podrían alterar la formación de los límites CID y, por tanto, la organización espacial del nucleoide. Es posible que los cambios en los límites de CID observados en la fase estacionaria se deban a la alta expresión de un conjunto diferente de genes en la fase estacionaria en comparación con la fase de crecimiento. ^[126]

Estructura nucleoide y expresión genética.

NAP y expresión genética.

La estructura cromosómica y la expresión genética de E. coli parecen influirse mutuamente de forma recíproca. Por un lado, una correlación de un límite CID con una alta actividad de transcripción indica que la organización cromosómica está impulsada por la transcripción. Por otro lado, la estructura tridimensional del ADN dentro del nucleoide en todas las escalas puede estar relacionada con la expresión genética. En primer lugar, se ha demostrado que la reorganización de la arquitectura 3D del nucleoide en E. coli puede modular dinámicamente el patrón de transcripción celular. ^[134] Un mutante de HUa hizo que el nucleoide se condensara mucho mediante una mayor superhelicidad positiva del ADN cromosómico. En consecuencia, muchos genes fueron reprimidos y muchos genes inactivos se expresaron. Además, hay muchos casos específicos en los que los cambios arquitectónicos locales mediados por proteínas alteran la transcripción genética. Por ejemplo, la formación de filamentos rígidos de nucleoproteínas por H-NS bloquea el acceso de RNAP al promotor, impidiendo así la transcripción genética. ^[135] A través del silenciamiento genético, H-NS actúa como un represor global inhibiendo preferentemente la transcripción de genes transferidos horizontalmente. ^{[50] [27]} En otro ejemplo, la unión específica de HU en el operón gal facilita la formación de un bucle de ADN que mantiene el operón gal reprimido en ausencia del inductor. ^[136] El microbucle de ADN topológicamente distinto creado por la flexión coherente del ADN por parte de Fis en promotores de ARN estables activa la transcripción. ^[77] La ​​flexión del ADN mediante IHF controla diferencialmente la transcripción de los dos promotores en tándem del operón ilvGMEDA en E. coli . ^{[137] [138]} Los cambios topológicos específicos de las NAP no solo regulan la transcripción de genes, sino que también están involucrados en otros procesos como el inicio de la replicación del ADN, la recombinación y la transposición. ^{[9] [10] [11]} A diferencia de la regulación genética específica, aún está por resolverse cómo la estructura cromosómica de orden superior y su dinámica influyen en la expresión genética globalmente a nivel molecular. ^[139]

Superenrollamiento del ADN y expresión genética.

Existe una interconexión bidireccional entre el superenrollamiento del ADN y la transcripción genética. ^[139] El superenrollamiento negativo de la región promotora puede estimular la transcripción facilitando la fusión del promotor y aumentando la afinidad de unión al ADN de una proteína reguladora. Los estallidos estocásticos de transcripción parecen ser una característica general de genes altamente expresados, y los niveles de superenrollamiento de la plantilla de ADN contribuyen al estallido transcripcional. ^[140] Según el modelo de dominio superenrollado gemelo, la transcripción de un gen puede influir en la transcripción de otros genes cercanos a través de un relevo superenrollado. Un ejemplo de ello es la activación del promotor leu-500 . ^[139] El superenrollamiento no solo media cambios específicos de genes, sino que también media cambios a gran escala en la expresión genética. La organización topológica del nucleoide podría permitir la expresión independiente de genes sensibles al superenrollamiento en diferentes dominios topológicos. Un mapa a escala del genoma de superenrollamiento desenfrenado mostró que las regiones genómicas tienen diferentes densidades de superenrollamiento en estado estacionario, lo que indica que el nivel de superenrollamiento difiere en los dominios topológicos individuales. ^[133] Como resultado, un cambio en el superenrollamiento puede resultar en una expresión genética de dominio específico, dependiendo del nivel de superenrollamiento en cada dominio. ^[133]

El efecto del superenrollamiento sobre la expresión génica puede estar mediado por NAP que influyen directa o indirectamente en el superenrollamiento. El efecto de HU sobre la expresión genética parece implicar un cambio en el superenrollamiento y quizás una organización del ADN de orden superior. Una correlación positiva entre la unión de la ADN girasa y la regulación positiva de los genes causada por la ausencia de HU sugiere que los cambios en el superenrollamiento son responsables de la expresión diferencial. También se descubrió que HU es responsable de un efecto posicional en la expresión génica al aislar unidades transcripcionales al restringir el superenrollamiento inducido por la transcripción. ^[141] Las mutaciones puntuales en HUa cambiaron drásticamente el perfil de expresión genética de E. coli, alterando su morfología , fisiología y metabolismo . Como resultado, la cepa mutante era más invasiva de las células de mamíferos. ^{[134] [142]} Este efecto dramático fue concomitante con la compactación de nucleoides y un aumento del superenrollamiento positivo. ^{[45] [143]} La proteína mutante era un octámero, en contraste con el dímero de tipo salvaje. Envuelve el ADN en su superficie de forma diestra, restringiendo las superenrollamientos positivas a diferencia del HU de tipo salvaje. ^[143] Estos estudios muestran que las sustituciones de aminoácidos en HU pueden tener un efecto dramático en la estructura de los nucleoides, lo que a su vez resulta en cambios fenotípicos significativos. ^[143]

Dado que MukB y HU se han convertido en actores críticos en las interacciones de ADN de largo alcance, valdrá la pena comparar el efecto de cada una de estas dos proteínas en la expresión genética global. ^[144] Aunque HU parece controlar la expresión génica mediante la modulación de la densidad de superenrollamiento, el mecanismo molecular exacto sigue siendo desconocido y el impacto de MukB en la expresión génica aún no se ha analizado. ^{[144] [145]}

Organización espacial

El nucleoide está organizado espacialmente en dominios de interacciones cromosómicas (CID) y macrodominios A. Los métodos de captura de conformación cromosómica (3C) investigan la organización del genoma 3D cuantificando las interacciones físicas entre loci genómicos que están cerca en el espacio 3D pero que pueden estar lejos en el genoma lineal. Un genoma se entrecruza con formaldehído para preservar los contactos físicos entre los loci genómicos. Posteriormente, el genoma se digiere con una enzima de restricción. En el siguiente paso, se lleva a cabo una ligadura de ADN en concentraciones de ADN diluido para favorecer la ligadura intramolecular (entre fragmentos entrecruzados que se acercan físicamente mediante la organización del genoma 3D). La frecuencia de eventos de ligación entre sitios de ADN distantes refleja una interacción física. En el método 3C, las uniones de ligación se detectan mediante amplificación por PCR semicuantitativa en la que la eficiencia de la amplificación es una estimación aproximada del contacto físico por pares entre las regiones genómicas de interés y su frecuencia. El método 3C investiga una interacción física entre dos regiones específicas identificadas a priori, mientras que su versión Hi-C detecta interacciones físicas entre todos los posibles pares de regiones genómicas simultáneamente. En el método Hi-C, los extremos digeridos se rellenan con un adaptador biotinilado antes de la ligadura. Los fragmentos ligados se cortan y luego se enriquecen mediante extracción de biotina. Luego, las uniones de ligación se detectan y cuantifican mediante métodos de secuenciación de próxima generación de extremos emparejados. B. Los datos Hi-C generalmente se representan en forma de una matriz bidimensional en la que los ejes x e y representan las coordenadas genómicas. El genoma suele dividirse en contenedores de un tamaño fijo, por ejemplo, 5 kb. El tamaño de los contenedores define esencialmente la resolución del contacto. Cada entrada en la matriz, m _ij , representa el número de lecturas de secuenciación quimérica asignadas a loci genómicos en los contenedores i y j. Una cuantificación de las lecturas (representada como un mapa de calor) denota la frecuencia relativa de los contactos entre los loci genómicos de los contenedores i y j. Una característica destacada del mapa de calor es una línea diagonal que aparece debido a una interacción física más frecuente entre loci que están muy cerca entre sí en el genoma lineal. La intensidad más alejada de la línea diagonal representa la frecuencia relativa de interacción física entre loci que están lejos unos de otros en el genoma lineal. Los triángulos de alta intensidad a lo largo de la línea diagonal representan dominios de interacción cromosómica (CID) altamente autointeractivos que están separados por una región límite que consta de un número menor de interacciones. C. En muchas especies bacterianas, incluida E. coli., parece que los dominios topológicos superenrollados se organizan como CID. El superenrollamiento plectonémico promueve un alto nivel de interacción entre los loci genómicos dentro de un CID, y una región libre de plectonema (PFR), creada debido a una alta actividad de transcripción, actúa como un límite de CID. Las proteínas asociadas a nucleoides, representadas como círculos cerrados, estabilizan las interacciones mediadas por superenrollamiento. La ARN polimerasa que transcribe activamente (representada como una esfera verde) en el PFR bloquea la disipación del superenrollamiento entre los dos dominios, por lo que actúa como una barrera de difusión del superenrollamiento. El tamaño de los CID oscila entre 30 y 400 kb. Varios triángulos (CID) se fusionan para formar un triángulo más grande que representa un macrodominio. En otras palabras, los CID de un macrodominio interactúan físicamente entre sí con más frecuencia que con los CID de un macrodominio vecino o con loci genómicos fuera de ese macrodominio. Un macrodominio puede comprender varios CID. Para simplificar, se muestra un macrodominio que comprende sólo dos CID.

Dominios de interacción cromosómica

En los últimos años, la llegada de un método molecular llamado captura de conformación cromosómica (3C) ha permitido estudiar una organización espacial de alta resolución de los cromosomas tanto en bacterias como en eucariotas. ^[146] 3C y su versión que se combina con secuenciación profunda (Hi-C) ^[147] determinan la proximidad física, si la hay, entre dos loci genómicos cualesquiera en el espacio 3D. Un mapa de contacto de alta resolución de cromosomas bacterianos, incluido el cromosoma de E. coli , ha revelado que un cromosoma bacteriano está segmentado en muchas regiones altamente autointeractivas llamadas dominios de interacción cromosómica (CID). ^{[126] [148] [149]} Los CID son equivalentes a los dominios de asociación topológica (TAD) observados en muchos cromosomas eucarióticos, ^[150] lo que sugiere que la formación de CID es un fenómeno general de la organización del genoma. Dos características definen los CID o TAD. Primero, las regiones genómicas de un CID interactúan físicamente entre sí con más frecuencia que con las regiones genómicas fuera de ese CID o con las de un CID vecino. En segundo lugar, la presencia de un límite entre los CID que impide las interacciones físicas entre regiones genómicas de dos CID vecinos. ^[126]

Se descubrió que el cromosoma de E. coli consta de 31 CID en la fase de crecimiento. El tamaño de los CID osciló entre 40 y ~300 kb. Parece que una barrera de difusión superenrollada responsable de segregar los bucles de ADN plectonémico en dominios topológicos funciona como un límite CID en E. coli y muchas otras bacterias. En otras palabras, la presencia de una barrera de difusión superenrollada define la formación de CID. Los hallazgos del sondeo Hi-C de cromosomas en E. coli , Caulobacter crescentus y Bacillus subtilis convergen en un modelo de que los CID se forman porque el bucle plectonémico junto con las actividades de organización del ADN de los NAP promueven interacciones físicas entre los loci genómicos, y un límite de CID consiste en una región libre de plectonema (PFR) que previene estas interacciones. Se crea un PFR debido a la alta actividad de transcripción porque el desenrollado helicoidal del ADN mediante la transcripción activa de RNAP restringe los superenrollamientos plectonémicos. Como resultado, la disipación de los superenrollamientos también se bloquea, creando una barrera de difusión de superenrollamiento. La evidencia indirecta de este modelo proviene de la observación de que los CID de cromosomas bacterianos, incluido el cromosoma de E. coli , muestran genes altamente transcritos en sus límites, lo que indica un papel de la transcripción en la formación de un límite CID. ^{[126] [148]} Pruebas más directas provinieron del hallazgo de que la colocación de un gen altamente transcrito en una posición donde no había ningún límite creó un nuevo límite CID en el cromosoma de C. crescentus . ^[148] Sin embargo, no todos los límites CID se correlacionaron con genes altamente transcritos en el cromosoma de E. coli , lo que sugiere que otros factores desconocidos también son responsables de la formación de límites CID y barreras de difusión superenrolladas. ^[148]

Macrodominios

Los bucles de ADN plectonémicos organizados como dominios topológicos o CID parecen fusionarse aún más para formar grandes dominios espacialmente distintos llamados macrodominios (MD). En E. coli, las MD se identificaron inicialmente como grandes segmentos del genoma cuyos marcadores de ADN se localizaban juntos (colocalizados) en estudios de hibridación fluorescente in situ (FISH). ^{[151] [152]} Una gran región genómica (~1 Mb) que cubre el locus oriC (origen de replicación cromosómica) se co-localizó y se denominó macrodominio Ori. Del mismo modo, una gran región genómica (~ 1 Mb) que cubre la región terminal de replicación ( ter ) se co-localizó y se denominó macrodominio Ter. Posteriormente, los MD se identificaron en función de la frecuencia con la que los pares de sitios lambda att que se insertaban en varias ubicaciones distantes del cromosoma se recombinaban entre sí. En este método basado en recombinación, una MD se definió como una gran región genómica cuyos sitios de ADN pueden recombinarse principalmente entre sí, pero no con aquellos fuera de esa MD. El método basado en recombinación confirmó los MD de Ori y Ter que se identificaron en los estudios FISH e identificó dos MD adicionales. ^{[12] [153]}

Los dos MD adicionales estaban formados por las regiones adicionales de ~ 1 Mb que flanqueaban el Ter y se denominaron Izquierda y Derecha. Estos cuatro MD (Ori, Ter, Izquierda y Derecha) componían la mayor parte del genoma, excepto dos regiones genómicas que flanqueaban a Ori. Estas dos regiones (NS-L y NS-R) eran más flexibles y no estructuradas en comparación con un MD, ya que los sitios de ADN en ellas se recombinaban con sitios de ADN ubicados en MD en ambos lados. La posición genética de oriC parece dictar la formación de MD, porque el reposicionamiento de oriC mediante manipulación genética da como resultado la reorganización de MD. Por ejemplo, las regiones genómicas más cercanas al oriC siempre se comportan como NS independientemente de la secuencia de ADN y las regiones más alejadas siempre se comportan como MD. ^[154]

La técnica Hi-C confirmó además una organización espacial jerárquica de los CID en forma de macrodominios. ^[126] En otras palabras, los CID de un macrodominio interactuaban físicamente entre sí con más frecuencia que con los CID de un macrodominio vecino o con loci genómicos fuera de ese macrodominio. Los datos de Hi-C mostraron que el cromosoma de E. coli se estaba dividiendo en dos dominios distintos. La región que rodea a ter formó un dominio aislado que se superpuso con el Ter MD previamente identificado. Los contactos ADN-ADN en este dominio se produjeron sólo en el rango de hasta ~280 kb. El resto del cromosoma formó un dominio único cuyos loci genómicos exhibieron contactos en el rango de >280 kb. ^[126] Si bien la mayoría de los contactos en este dominio estaban restringidos a una distancia máxima de ~500 kb, había dos regiones sueltas cuyos loci genómicos formaban contactos a distancias aún mayores (hasta ~1 Mb). Estas regiones sueltas correspondían a las regiones flexibles y menos estructuradas (NS) previamente identificadas. Los límites del dominio aislado que abarca ter y las dos regiones sueltas identificadas por el método Hi-C segmentaron todo el cromosoma en seis regiones que se corresponden con las cuatro regiones MD y dos NS definidas mediante ensayos basados ​​en recombinación. ^[126]

Proteínas que impulsan la formación de macrodominios.

MatP

Ocupación de todo el genoma de MatP y MukB de E. coli Un diseño circular del genoma de E. coli que representa la ocupación de todo el genoma de MatP y MukB en E. coli . El círculo más interno representa el genoma de E. coli . Las regiones del genoma que se organizan como dominios espaciales (macrodominios) en el nucleoide se indican como bandas coloreadas. En los círculos exteriores se muestran los gráficos de histograma de la ocupación del genoma de MatP y MukB según lo determinado por inmunoprecipitación de cromatina junto con secuenciación de ADN (ChIP-seq). El tamaño del contenedor de los histogramas es de 300 pb. La figura se preparó en circos/0,69-6 utilizando los datos procesados ​​de ChIP-Seq. ^[155]

Una búsqueda de proteínas responsables de la formación de macrodominios condujo a la identificación de la proteína Macrodominio Ter (MatP). MatP se une casi exclusivamente en Ter MD reconociendo un motivo de 13 pb llamado secuencia macrodominio ter ( matS ). ^[32] Hay 23 sitios matS presentes en el dominio Ter, en promedio hay un sitio cada 35 kb. Más evidencia de la unión de MatP en el dominio Ter proviene de imágenes de fluorescencia de MatP. Se observaron focos discretos de MatP que se co-localizaron con marcadores de ADN del dominio Ter. ^[32] Un fuerte enriquecimiento de la señal ChIP-Seq en Ter MD también corrobora la unión preferencial de MatP a este dominio. ^[32]

MatP condensa ADN en el dominio Ter porque la falta de MatP aumentó la distancia entre dos marcadores de ADN fluorescentes ubicados a 100 kb de distancia en el dominio Ter. Además, MatP es un actor fundamental a la hora de aislar el dominio Ter del resto del cromosoma. ^[126] Promueve los contactos ADN-ADN dentro del dominio Ter pero previene los contactos entre los loci de ADN del dominio Ter y los de las regiones flanqueantes. ¿Cómo condensa MatP el ADN y promueve los contactos ADN-ADN? Los resultados experimentales son contradictorios. MatP puede formar un bucle de ADN entre dos sitios matS in vitro y su actividad de bucle de ADN depende de la tetramerización de MatP. La tetramerización se produce mediante interacciones en espiral entre dos moléculas de MatP unidas al ADN. ^[156] Un modelo obvio basado en resultados in vitro es que MatP promueve los contactos ADN-ADN in vivo al unir sitios matS . Sin embargo, aunque MatP conectó sitios distantes en estudios de Hi-C, no conectó específicamente los sitios matS . Además, un mutante de MatP que no pudo formar tetrámeros se comportó como un tipo salvaje. Estos resultados van en contra del modelo de puente matS para la organización Ter, dejando el mecanismo de acción MatP difícil de alcanzar. Una posibilidad es que MatP se propague a segmentos de ADN cercanos desde su sitio de unión primario matS y une sitios distantes mediante un mecanismo que no depende de la tetramerización. ^[156]

MukBEF

Modelos para la organización del ADN por MatP y MukBEF A. Un modelo puente matS para la organización del ADN en el macrodominio Ter por MatP. MatP reconoce una secuencia de ADN característica de 13 pb llamada matS que está presente exclusivamente en el macrodominio Ter. Hay 23 sitios matS separados entre sí por un promedio de 35 kb. MatP se une a un sitio matS como un dímero, y la tetramerización de los dímeros unidos al ADN une los sitios matS formando grandes bucles de ADN. B. La arquitectura del complejo E. coli MukBEF. El complejo está formado por interacciones proteína-proteína entre MukB (azul), MukF (naranja oscuro) y MukE (naranja claro). MukB, que pertenece a la familia de proteínas de mantenimiento estructural de los cromosomas (SMC), forma un dímero (los monómeros se muestran en colores azul oscuro y claro) que consta de un dominio de cabeza de ATPasa y una espiral intramolecular de 100 nm de largo con una región bisagra. en el centro. Debido a la flexibilidad de la región de la bisagra, MukB adopta una forma de V característica de la familia SMC. MukF también tiende a existir como dímero debido a la fuerte afinidad de dimerización entre los monómeros. ^{[157] [158]} El dominio C-terminal de MukF puede interactuar con el dominio principal de MukB, mientras que su dominio central puede interactuar con MukE. Dos moléculas de MukE y una molécula de MukF se asocian entre sí independientemente de MukB para formar un complejo trimérico (MukE ₂ F). Dado que MukF tiende a existir en forma dimérica, la dimerización de MukF da como resultado un complejo hexámero alargado (MukE ₂ F) ₂ . ^[159] En ausencia de ATP, el complejo (MukE ₂ F) ₂ se une a los dominios principales de MukB a través del dominio C-terminal de MukF para formar un complejo MukBEF simétrico (que se muestra a la izquierda). La estequiometría del complejo simétrico es B ₂ (E ₂ F) ₂ . La unión de ATP entre los dominios principales de MukB fuerza el desprendimiento de una molécula de MukF y dos moléculas de MukE. ^{[132] [159]} Como resultado, se forma un complejo MukBEF asimétrico de estequiometría B ₂ (E ₂ F) _{1 .} Dado que MukF se dimeriza fácilmente, la dimerización de MukF puede potencialmente unir dos moléculas asimétricas unidas a ATP, lo que da como resultado la formación de un dímero de dímeros con la estequiometría de B ₄ (E ₂ F) ₂ (que se muestra a la derecha). Se estima que la estequiometría del complejo MukBEF in vivo es B ₄ (E ₂ F) ₂lo que sugiere que un dímero de dímeros es la unidad funcional in vivo . ^[160] C. Un modelo para la extrusión de bucles mediante un dímero de dímeros MukBEF. Un dímero de dímero se carga en el ADN (representado como una línea gris) a través de los dominios de unión al ADN de MukB. Se ha demostrado que MukB se une al ADN a través de su región bisagra y la región superior de su dominio principal. ^{[48] ​​[161]} La translocación del complejo lejos de su sitio de carga extruye bucles de ADN. Los bucles se extruyen a modo de escalada mediante la apertura y el cierre coordinados del anillo MukBEF a través de la desconexión de la cabeza MukB que se produce debido a la hidrólisis coordinada de ATP en los dos dímeros. ^[160] Los círculos azul oscuro y claro representan eventos de unión e hidrólisis de ATP, respectivamente. MukE no se muestra en el complejo por simplicidad.

MukB pertenece a una familia de ATPasas llamadas proteínas de mantenimiento estructural de los cromosomas (SMC), que participan en la organización cromosómica de orden superior en eucariotas. ^[145] Dos monómeros MukB se asocian mediante una interacción continua antiparalela en espiral formando una varilla rígida de 100 nm de largo. En el centro de la varilla se produce una región de bisagra flexible. ^{[162] [163]} Debido a la flexibilidad de la región de la bisagra, MukB adopta una forma de V característica de la familia SMC. Las subunidades no SMC que se asocian con MukB son MukE y MukF. La asociación cierra la formación V, dando como resultado grandes estructuras en forma de anillos. MukE y MukF están codificados junto con MukB en el mismo operón en E. coli . ^[164] La eliminación de cualquiera de las subunidades produce el mismo fenotipo, lo que sugiere que el complejo MukBEF es la unidad funcional in vivo . ^[160] Las actividades de unión al ADN del complejo residen en la subunidad MukB, mientras que MukE y MukF modulan la actividad de MukB. ^[164]

El complejo MukBEF, junto con Topo IV, es necesario para la decatenación y reposicionamiento de oriC recién replicados . ^{[165] [166] [167] [168] [155]} El papel de MukBEF no está restringido durante la replicación del ADN. Organiza y condensa el ADN incluso en células que no se replican. ^[131] El reciente mapa de conformación cromosómica de alta resolución de la cepa de E. coli empobrecida en MukB revela que MukB participa en la formación de interacciones ADN-ADN en todo el cromosoma, excepto en el dominio Ter. ^[126] ¿Cómo se impide que MukB actúe en el dominio Ter? MatP interactúa físicamente con MukB, evitando así que MukB se localice en el dominio Ter. ^[155] Esto es evidente en la unión al ADN de MatP y MukB en el dominio Ter. La unión al ADN de MatP se enriquece en el dominio Ter, mientras que la unión al ADN de MukB se reduce en comparación con el resto del genoma. Además, en una cepa que ya carece de MatP, la ausencia de MukB provoca una reducción de los contactos del ADN en todo el cromosoma, incluido el dominio Ter. ^[126] Este resultado concuerda con la opinión de que MatP desplaza a MukB del dominio Ter. ^[126]

¿Cómo funciona el complejo MukBEF para organizar el cromosoma de E. coli ? Según la opinión actual, los complejos SMC organizan los cromosomas mediante la extrusión de bucles de ADN. ^[169] Los complejos de SMC se translocan a lo largo del ADN para extruir bucles de manera cis (en la misma molécula de ADN), donde el tamaño de los bucles depende de la procesividad del complejo. Los complejos SMC de diferentes organismos difieren en el mecanismo de extrusión del bucle. ^[169] La microscopía de fluorescencia de molécula única de MukBEF en E. coli sugiere que la unidad funcional mínima in vivo es un dímero de dímeros. ^[160] Esta unidad se forma mediante la unión de dos complejos MukBEF unidos a ATP mediante dimerización mediada por MukF. MukBEF se localiza en la célula como 1-3 grupos que se alargan paralelos al eje longitudinal de la célula. Cada grupo contiene un promedio de ~ 8-10 dímeros de dímeros. Según el modelo actual, MukBEF extruye bucles de ADN a modo de “escalada en roca”. ^{[160] [170]} Un dímero de dímeros libera un segmento de ADN y captura un nuevo segmento de ADN sin disociarse del cromosoma. Además del bucle de ADN, un vínculo entre el superenrollamiento negativo y la función MukBEF in vivo junto con la capacidad de la subunidad MukB para restringir los superenrollamientos negativos in vitro sugiere que MukBEF organiza el ADN generando superenrollamientos. ^{[171] [172] [173]}

Papel de los NAP y los naRNA

Además de contribuir a la compactación de los cromosomas al doblar, formar puentes y formar bucles en el ADN a una escala más pequeña (~1 kb), los NAP participan en la condensación y organización del ADN al promover contactos de largo alcance entre ADN y ADN. Dos NAP, Fis y HU, surgieron como actores clave en la promoción de contactos ADN-ADN de largo alcance que ocurren en todo el cromosoma. ^[126] Queda por estudiar cómo las actividades de organización del ADN de Fis y HU, que se comprenden bien a una escala más pequeña (~ 1 kb), dan como resultado la formación de interacciones ADN-ADN de largo alcance. No obstante, algunas de las interacciones de ADN mediadas por HU requieren la presencia de naRNA4. ^[86] naRNA4 también participa en la realización de contactos de ADN de largo alcance. HU cataliza algunos de los contactos, no todos, lo que sugiere que el ARN participa con otros NAP en la formación de contactos de ADN. HU también parece actuar junto con MukB para promover interacciones ADN-ADN de largo alcance. Esta opinión se basa en observaciones de que la ausencia de HU o MukB provocó una reducción en los mismos contactos ADN-ADN. No está claro cómo MukB y HU actúan potencialmente juntos para promover las interacciones ADN-ADN. Es posible que las dos proteínas interactúen físicamente. Alternativamente, mientras MukBEF extruye grandes bucles de ADN, HU condensa y organiza esos bucles. ^{[169] [48]}

Papel de la relación funcional de los genes.

Hay informes de que genes de E. coli relacionados funcionalmente están físicamente juntos en un espacio tridimensional dentro del cromosoma a pesar de que están muy separados por la distancia genética. La proximidad espacial de genes funcionalmente relacionados no sólo hace que las funciones biológicas sean más compartimentadas y eficientes, sino que también contribuiría al plegamiento y la organización espacial del nucleoide. Un estudio reciente que utilizó marcadores fluorescentes para la detección de loci de ADN específicos examinó las distancias físicas por pares entre los siete operones de ARNr que están genéticamente separados entre sí (hasta por dos millones de pb). Informó que todos los operones, excepto rrn C, estaban físicamente cerca. ^{[174] [175]} Sorprendentemente, los estudios 3C-seq no revelaron la agrupación física de los operones rrn , lo que contradice los resultados del estudio basado en fluorescencia. ^[126] Por lo tanto, se requiere mayor investigación para resolver estas observaciones contradictorias. En otro ejemplo, GalR forma una red de interacción de sitios de unión de GalR que están dispersos por todo el cromosoma. ^[176] GalR es un regulador transcripcional del regulón de galactosa compuesto de genes que codifican enzimas para el transporte y el metabolismo del azúcar D-galactosa. ^[177] GalR existe sólo en uno o dos focos en las células ^[176] y puede autoensamblarse en grandes estructuras ordenadas. ^[178] Por lo tanto, parece que GalR unido al ADN se multimeriza para formar interacciones a larga distancia. ^{[176] [178]}

Forma y estructura global

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) convencional de células de E. coli fijadas químicamente mostró el nucleoide como un orgánulo de forma irregular . Sin embargo, las imágenes de fluorescencia de campo amplio de nucleoides vivos en 3D revelaron una forma elipsoide discreta. ^{[3] [14] [15]} La superposición de una imagen de contraste de fases de la célula y la imagen fluorescente del nucleoide mostró una yuxtaposición cercana sólo en la dimensión radial a lo largo de toda su longitud del nucleoide hasta la periferia de la célula. Este hallazgo indica confinamiento radial del nucleoide. ^[13] Un examen detallado de la imagen de fluorescencia 3D después de un corte transversal perpendicular a su eje largo reveló además dos características globales del nucleoide: curvatura y regiones longitudinales de alta densidad. Examinar la quiralidad de la línea central del nucleoide conectando el centro de intensidad de cada sección transversal mostró que la forma general del nucleoide es curva. ^[15] La distribución de la intensidad de la fluorescencia en las secciones transversales reveló una subestructura de densidad, que consta de regiones o haces curvos de alta densidad en el núcleo central y regiones de baja densidad en la periferia. ^{[13] [14]} Una implicación del confinamiento radial es que determina la forma curva del nucleoide. Según un modelo, el nucleoide se ve obligado a doblarse porque está confinado en una célula cilíndrica de E. coli cuyo radio es menor que su longitud flexible (longitud de persistencia). ^[13] Este modelo fue respaldado por observaciones de que la eliminación de la pared celular o la inhibición de la síntesis de la pared celular aumentaba el radio de la célula y daba como resultado un aumento concomitante en el radio helicoidal y una disminución en el paso helicoidal en el nucleoide. ^[13]

Nucleoide como elipsoide helicoidal con regiones longitudinales de ADN de alta densidad A. Una caricatura de una célula de E. coli con un nucleoide curvo (gris oscuro). Una trayectoria de centroides curva, indicada por puntos rojos y verdes, enfatiza la forma curva del nucleoide ^[13] B. Corte transversal del nucleoide de E. coli visualizado por HU-mCherry. La intensidad de la fluorescencia se toma como indicador de la densidad del ADN y se representa de azul a rojo en orden creciente. ^[14]

Conexiones de membrana nucleoide

Una fuerza de expansión debida a las conexiones de la membrana del ADN parece funcionar en oposición a las fuerzas de condensación para mantener un nivel óptimo de condensación del nucleoide. Los estudios de fraccionamiento celular y microscopía electrónica indicaron por primera vez la posibilidad de conexiones entre el ADN y la membrana. ^{[179] [180]} En la actualidad existen varios ejemplos conocidos de conexiones de membrana de ADN. La transerción es un mecanismo de transcripción, traducción e inserción concurrentes de proteínas de membrana nacientes que forman contactos transitorios entre el ADN y la membrana. ^[181] Se ha demostrado que la transición de dos proteínas de membrana, LacY y TetA, provoca el reposicionamiento de loci cromosómicos hacia la membrana. ^[182] Otro mecanismo de conexiones nucleoide-membrana es a través de un contacto directo entre los reguladores de la transcripción anclados a la membrana y sus sitios objetivo en el cromosoma. Un ejemplo de regulador de la transcripción en E. coli es CadC. CadC contiene un dominio sensorial periplásmico y un dominio de unión al ADN citoplasmático. La detección de un ambiente ácido por su dominio sensorial periplásmico estimula la actividad de unión al ADN de CadC, que luego activa la transcripción de sus genes diana. ^[183] ​​La localización en la membrana de genes regulados por un regulador de la transcripción anclado a la membrana aún no se ha demostrado. No obstante, se espera que la activación de genes diana en el cromosoma por parte de estos reguladores dé como resultado un contacto nucleoide-membrana, aunque sería un contacto dinámico. Además de estos ejemplos, el cromosoma también está anclado específicamente a la membrana celular a través de la interacción proteína-proteína entre proteínas unidas al ADN, por ejemplo, SlmA y MatP, y el divisoma . ^{[184] [185]} Dado que los genes que codifican proteínas de membrana se distribuyen por todo el genoma, los contactos dinámicos entre el ADN y la membrana a través de la transerción pueden actuar como una fuerza de expansión de nucleoides. Esta fuerza de expansión funcionaría en oposición a las fuerzas de condensación para mantener un nivel de condensación óptimo. La formación de nucleoides altamente condensados ​​tras la exposición de células de E. coli al cloranfenicol, que bloquea la traducción, proporciona apoyo a la fuerza de expansión de los contactos transitorios entre el ADN y la membrana formados mediante la transerción. ^{[186] [187]} La ​​forma redonda de los nucleoides excesivamente condensados ​​después del tratamiento con cloranfenicol también sugiere un papel de los contactos de la membrana del ADN mediados por transerción en la definición de la forma elipsoide del nucleoide. ^[187]

Visualización

El nucleoide se puede visualizar claramente en una micrografía electrónica con un aumento muy alto , donde, aunque su apariencia puede diferir, es claramente visible contra el citosol . ^[188] A veces incluso son visibles hebras de lo que se cree que es ADN . Al teñir con la tinción de Feulgen , que tiñe específicamente el ADN, el nucleoide también puede verse bajo un microscopio óptico . ^[189] Las tinciones intercalantes de ADN DAPI y bromuro de etidio se utilizan ampliamente para la microscopía de fluorescencia de nucleoides. Tiene una forma irregular y se encuentra en las células procarióticas. ^{[13] [14]}

Daño y reparación del ADN.

Se observan cambios en la estructura del nucleoide de bacterias y arqueas después de la exposición a condiciones que dañan el ADN. Los nucleoides de las bacterias Bacillus subtilis y Escherichia coli se vuelven significativamente más compactos después de la irradiación UV. ^{[190] [191]} La formación de la estructura compacta en E. coli requiere la activación de RecA a través de interacciones específicas RecA-ADN. ^[192] La proteína RecA desempeña un papel clave en la reparación recombinacional homóloga del daño del ADN.

Al igual que B. subtilis y E. coli anteriormente, la exposición del arqueón Haloferax volcanii a tensiones que dañan el ADN provocan la compactación y reorganización del nucleoide. ^[193] La compactación depende del complejo proteico Mre11-Rad50 que cataliza un paso temprano en la reparación recombinacional homóloga de roturas de doble hebra en el ADN. Se ha propuesto que la compactación de nucleoides es parte de una respuesta al daño del ADN que acelera la recuperación celular al ayudar a las proteínas reparadoras del ADN a localizar objetivos y al facilitar la búsqueda de secuencias de ADN intactas durante la recombinación homóloga. ^[193]

Ver también

• plásmido
• Recombinación homóloga
• reparación de ADN

Referencias

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