El ADN cruciforme es una forma de ADN no B , o una estructura de ADN alternativa . La formación de ADN cruciforme requiere la presencia de palíndromos llamados secuencias de repetición invertidas . [1] Estas repeticiones invertidas contienen una secuencia de ADN en una hebra que se repite en la dirección opuesta en la otra hebra. Como resultado, las repeticiones invertidas son autocomplementarias y pueden dar lugar a estructuras como horquillas y cruciformes. Las estructuras de ADN cruciforme requieren al menos una secuencia de seis nucleótidos de repeticiones invertidas para formar una estructura que consiste en un tallo, un punto de ramificación y un bucle en forma de cruciforme, estabilizado por superenrollamiento negativo del ADN . [1] [2]
Se han descrito dos clases de ADN cruciforme: plegado y desplegado. Las estructuras cruciformes plegadas se caracterizan por la formación de ángulos agudos entre los brazos adyacentes y la cadena principal de ADN. Las estructuras cruciformes desplegadas tienen una geometría plana cuadrada y una simetría cuádruple en la que los dos brazos del cruciforme son perpendiculares entre sí. [2] Se han descrito dos mecanismos para la formación de ADN cruciforme: tipo C y tipo S. [3] La formación de estructuras cruciformes en ADN lineal es termodinámicamente desfavorable debido a la posibilidad de desapilamiento de bases en los puntos de unión y regiones abiertas en los bucles. [2]
El ADN cruciforme se encuentra tanto en procariotas como en eucariotas y tiene un papel en la transcripción y replicación del ADN, la reparación de la doble cadena , la translocación y la recombinación del ADN . También cumple una función en la regulación epigenética junto con implicaciones biológicas como el superenrollamiento del ADN, las roturas de la doble cadena y los objetivos para las proteínas de unión cruciformes. [4] [5] [6] Las estructuras cruciformes pueden aumentar la inestabilidad genómica y están involucradas en la formación de varias enfermedades, como el cáncer y la enfermedad de Werner. [7] [8] [9]
La primera descripción teórica de las estructuras de ADN formadoras de cruciformes se planteó a principios de la década de 1960. [10] Alfred Gierer fue uno de los primeros científicos en proponer una interacción entre las proteínas y los surcos de secuencias de nucleótidos de ADN bicatenario específicas. [11] Si había secuencias repetidas invertidas, se especuló que el ADN bicatenario formaba ramas y bucles. [11] Se planteó la hipótesis de que las proteínas se unían a estas estructuras de ADN ramificadas y causaban la regulación de la expresión génica. [11] La asociación de unión entre las proteínas y el ADN formador de ramas se sugirió debido a la estructura y función del ARNt . [11] A medida que el ARNt se pliega sobre sí mismo en presencia de bases complementarias emparejadas, provoca la formación de ramas y bucles que son componentes clave en las interacciones con las proteínas. A principios de la década de 1980, se caracterizaron los sitios de reconocimiento del ADN que formaban estructuras de horquilla para una variedad de proteínas celulares. [10]
El mecanismo de extrusión cruciforme ocurre a través de la apertura del ADN bicatenario para permitir el apareamiento de bases intracatenario. [12] El mecanismo de esta apertura se clasifica en dos tipos: tipo C y tipo S. La formación cruciforme de tipo C está marcada por una gran apertura inicial en el ADN bicatenario. Esta apertura tiene varios nucleótidos de adenina y timina distales a la repetición invertida. [3] A medida que la sección desenrollada se hace más grande, ambos lados de la repetición invertida se desenrollan y se produce el apareamiento de bases intracatenario. Esto conduce a la formación de una estructura cruciforme. La formación cruciforme de tipo C depende de la temperatura debido a una mayor entropía y entalpía de activación que la de tipo S. [3] A diferencia del tipo C, la formación cruciforme de tipo S requiere sal para la extrusión. [3] Comienza con un estado desenrollado más pequeño de aproximadamente diez pares de bases en el centro de la repetición invertida. [12] A medida que se produce el apareamiento de bases intracatenario, se forma un protocruciforme. En un protocruciforme, los tallos de la estructura están parcialmente formados y no completamente extruidos. Por lo tanto, un protocruciforme se considera un paso intermedio antes de la conformación cruciforme final producida. [3] A medida que el estado desenrollado se hace más grande, los tallos se alargan a través de un proceso llamado migración de ramas. [13] Esto finalmente forma un cruciforme completamente extruido.
La formación cruciforme depende de varios factores, entre ellos la temperatura, el sodio, el magnesio y la presencia de ADN superenrollado negativamente. Como se mencionó anteriormente, el mecanismo de tipo C de extrusión cruciforme depende de la temperatura; sin embargo, se ha observado que 37 °C es óptimo para la formación cruciforme. [14] Además, la presencia o ausencia de iones de sodio y magnesio puede afectar la conformación del cruciforme adoptado. [14] A una alta concentración de iones de sodio y en ausencia de iones de magnesio, se forma una estructura cruciforme compacta y plegada. Aquí, los tallos forman ángulos agudos con la cadena principal de ADN en lugar de compartir 90° entre ellos. [13] A una menor concentración de iones de sodio y en ausencia de iones de magnesio, el cruciforme adopta una conformación plana cuadrada simétrica con tallos completamente extendidos. [13] En presencia de iones de magnesio y sin iones de sodio, se adopta una conformación compacta y plegada, similar a la formada a altas concentraciones de sodio. La conformación formada aquí tiene simetría, a diferencia de la conformación plegada formada a altas concentraciones de iones de sodio. [13] Por último, la formación de ADN cruciforme es cinéticamente desfavorable. Cuando el ADN se enfrenta a un estrés significativo, se adopta una conformación superenrollada negativa. Una conformación superenrollada negativa se caracteriza por menos vueltas helicoidales que el ADN relajado. La hélice de ADN superenrollada negativamente se vuelve flexible cuando se forma una estructura cruciforme y se produce el apareamiento de bases intracatenario. Como resultado, la formación de la estructura cruciforme se vuelve termodinámicamente favorable cuando está presente un dominio de ADN superenrollado negativo. [13] [15]
Se ha descubierto que las estructuras cruciformes desempeñan un papel en la regulación epigenética y otras implicaciones biológicas importantes. Estas implicaciones biológicas van desde afectar el superenrollamiento del ADN, causar roturas de doble cadena en el ADN cromosómico y servir como objetivos para que las proteínas se unan al ADN. [10] [5] [6] Se ha descubierto que una multitud de proteínas de unión cruciformes interactúan con estructuras de ADN cruciformes que actúan como señales de reconocimiento y realizan funciones asociadas con factores de transcripción , replicación de ADN y actividad de endonucleasa. [10] [16] Estas proteínas de unión cruciformes se unen a la base de la estructura de tallo-bucle cerca de la unión de cuatro vías que se supone en las estructuras de ADN cruciformes. [17]
Se sabe que la familia de proteínas 14-3-3 interactúa con secuencias repetidas invertidas que pueden formar ADN cruciforme mientras regulan la replicación del ADN en células eucariotas. [10] [18] El B-ADN puede formar estructuras transitorias de ADN cruciforme que actúan como señales de reconocimiento cerca de los orígenes de replicación en el ADN de estas células eucariotas. [10] Se ha descubierto que esta asociación entre la familia de proteínas 14-3-3 y las secuencias repetidas invertidas ocurre al comienzo de la fase S del ciclo celular. [10] La interacción entre las proteínas 14-3-3 y el ADN cruciforme cumple una función en la activación del origen que, a su vez, activará la helicasa del ADN para comenzar el proceso de replicación del ADN. [10] [19] Las proteínas 14-3-3 se disocian después de ayudar en el paso de iniciación de la replicación del ADN. [10] [20]
Se ha descubierto que las secuencias repetidas invertidas que sugieren estructuras cruciformes actúan como sitios diana donde las endonucleasas pueden escindirse. [21] [22] Se ha descubierto que una endonucleasa del organismo Saccharomyces cerevisiae , Mus81-Mms4, interactúa con una proteína denominada Crp1 que reconoce las supuestas estructuras cruciformes. [22] Crp1 se identificó por separado como una proteína de unión a cruciformes en S. cerevisiae porque tenía una alta afinidad para dirigirse a secuencias repetidas invertidas sintéticas. [21] Además, en presencia de la proteína Crp1, la actividad endonucleasa de Mus81-Mms4 aumenta. [22] Esto sugiere que las secuencias repetidas invertidas pueden mejorar la actividad de endonucleasas como Mus81-Mms4 cuando se unen a Crp1. [22]
Se ha descubierto que endonucleasas específicas como la endonucleasa T7 y S1 reconocen y escinden secuencias repetidas invertidas dentro de los plásmidos pVH51 y pBR322 . [23] Las secuencias repetidas invertidas en estos plásmidos mostraron mellas en la cadena de ADN que llevaron a la linealización del plásmido. [23] También se observaron secuencias repetidas invertidas en pLAT75 in vivo. [16] pLAT75 se deriva de pBR322 (que se encuentra en Escherichia coli ) después de que se transfecta con colE1, una secuencia repetida invertida. [16] En presencia de la endonucleasa T7, pLAT75 adoptó una estructura lineal después de la escisión en el sitio de la secuencia colE1. [16]
Las estructuras cruciformes del ADN se estabilizan mediante el superenrollamiento y su formación alivia el estrés generado por el superenrollamiento del ADN. Las estructuras cruciformes bloquean el reconocimiento del promotor tet en pX por la ARN polimerasa. Las estructuras cruciformes también pueden interrumpir un paso en la vía cinética, como se muestra cuando la girasa es inhibida por la novobiocina . Las estructuras cruciformes regulan la iniciación de la transcripción [4], como la supresión de la transcripción de pX. La replicación del ADN puede entonces ser inhibida por estructuras terciarias que contienen cruciformes de ADN formadas durante la recombinación, [24] que pueden estudiarse para ayudar a tratar la malignidad. La recombinación también se observa en las uniones de Holliday , un tipo de estructura cruciforme.
En los plásmidos bacterianos , RuvA y RuvB reparan el daño del ADN y están involucradas en el proceso de recombinación de las uniones de Holliday. [24] Estas proteínas también son responsables de regular la migración de las ramas . Durante la migración de las ramas, el complejo RuvAB ayuda a iniciar la recombinación cuando se une y descomprime la unión de Holliday, como la helicasa de ADN, y también cuando se escinde el complejo de unión RuvAB/Holliday, una vez que RuvC se une a él.
Otro ejemplo de la importancia de la estructura cruciforme se observa en la interacción entre p53 , un supresor tumoral, y secuencias formadoras cruciformes. La unión de p53 se correlaciona con secuencias repetidas invertidas, como las que ayudan a formar estructuras de ADN cruciformes. Bajo estrés superhelicoidal negativo, p53 se une preferentemente a dianas formadoras cruciformes debido al entorno rico en A/T que presenta estas secuencias repetidas invertidas necesarias. [25]
El ADN no B con alta capacidad de formación cruciforme se correlaciona con tasas significativamente más altas de mutación en comparación con el ADN B. [26] Estas mutaciones incluyen sustituciones e inserciones de bases individuales, pero con mayor frecuencia las estructuras cruciformes conducen a la eliminación de material genético. En el genoma humano, las estructuras de ADN cruciforme están presentes en mayor densidad dentro y alrededor de los sitios frágiles cromosómicos , que son segmentos de ADN que experimentan estrés de replicación y son más propensos a romperse. Las estructuras cruciformes contribuyen a la inestabilidad, translocaciones y deleciones comunes en los sitios frágiles al promover roturas de doble cadena. [7] [27] Esto ocurre porque el ADN cruciforme inapropiado es un objetivo potencial para la escisión bicatenaria de endonucleasas, con mayor frecuencia en los extremos del bucle. [28] Las roturas de doble cadena en el ADN pueden desencadenar una reparación incorrecta del ADN, translocaciones cromosómicas y, en casos graves, la degradación del ADN, que es letal para la célula. A menudo, secuencias enteras formadoras de cruciformes son cortadas por error por enzimas de reparación de ADN y degradadas, lo que puede alterar el funcionamiento celular si la secuencia formadora de cruciformes estaba dentro de un gen.
Además, la formación de ADN cruciforme detiene la replicación y la transcripción cuando las hebras se separan, lo que puede provocar que las enzimas reparadoras del ADN añadan o eliminen por error pares de bases. [27] [28] El estancamiento de la replicación y la transcripción suele provocar la eliminación de la secuencia de ADN cruciforme por parte de las enzimas reparadoras, de forma similar al mecanismo observado en los sitios frágiles de los cromosomas. Existe un mayor riesgo de colisión de la replicación y la transcripción debido al estancamiento cruciforme, lo que contribuye aún más a la inestabilidad genómica. [28]
La alta inestabilidad genómica de las secuencias de ADN que forman estructuras cruciformes las hace propensas a mutaciones y deleciones, algunas de las cuales contribuyen al desarrollo del cáncer. Las estructuras cruciformes inapropiadas se encuentran con mayor frecuencia en tejidos altamente proliferativos y células que se dividen rápidamente, y por lo tanto desempeñan un papel en la proliferación celular descontrolada de la tumorogénesis. [7] Existen varios mecanismos celulares para prevenir las discrepancias genómicas causadas por las estructuras cruciformes, pero la interrupción de estos procesos puede conducir a neoplasias malignas. Las oncoproteínas arquitecturales humanas, como DEK, se unen preferentemente a las estructuras cruciformes durante la replicación y la transcripción para prevenir roturas de doble cadena o reparaciones erróneas del ADN. [29] El mal funcionamiento de las oncoproteínas arquitecturales, como se observa en los cánceres de pulmón, mama y otros, así como en los trastornos autoinmunes, conduce a la formación descontrolada de estructuras de ADN cruciformes y la promoción de roturas de doble cadena. La proteína BRCA1 , un supresor tumoral que funciona en la reparación del ADN, se une preferentemente a las estructuras cruciformes. [30] Las mutaciones en el gen BRCA1 o la ausencia de la proteína BRCA1 funcional contribuyen al desarrollo de cáncer de mama, ovario y próstata. La inactivación de p53 , una proteína supresora de tumores que se une preferentemente a las estructuras cruciformes, es responsable de más del 50% del desarrollo de tumores humanos. [31] La proteína IFI16 modula el funcionamiento de p53 e inhibe la proliferación celular en la vía de señalización RAS/RAF. IFI16 tiene una alta afinidad de unión a las estructuras cruciformes, y las mutaciones en el gen IFI16 se han relacionado con el sarcoma de Kaposi . [32]
Si bien las estructuras cruciformes de ADN están implicadas en el desarrollo del cáncer, su estructura única permite el transporte confiable de medicamentos de quimioterapia. Actualmente, se está investigando el ADN cruciforme como un mecanismo potencial para el tratamiento del cáncer, y la administración dirigida de agentes anticancerígenos a células tumorígenas mediante segmentos de ADN cruciforme especialmente construidos ha demostrado ser eficaz para reducir el tamaño de los tumores en cánceres malignos de pulmón, mama y colon. [33] [34]
El síndrome de Werner es un trastorno genético que provoca envejecimiento prematuro. Los pacientes con síndrome de Werner carecen de una proteína WRN funcional, que forma parte de la familia RecQ de helicasas de ADN. En concreto, la proteína WRN desenrolla las uniones de Holliday, que son un subconjunto de las estructuras cruciformes del ADN, para evitar el estancamiento de la replicación del ADN. [35] [8]