La replicación del ADN procariota es el proceso por el cual un procariota duplica su ADN en otra copia que se transmite a las células hijas. [1] Aunque a menudo se estudia en el organismo modelo E. coli , otras bacterias muestran muchas similitudes. [2] La replicación es bidireccional y se origina en un único origen de replicación (OriC). [3] Consta de tres pasos: iniciación, elongación y terminación. [4]
Todas las células deben terminar la replicación del ADN antes de poder proceder a la división celular. Las condiciones del medio que favorecen el crecimiento rápido en las bacterias también se combinan con un tiempo de interiniciación más corto en ellas, es decir, el tiempo de duplicación en las células de crecimiento rápido es menor en comparación con el crecimiento lento. [5] En otras palabras, es posible que en condiciones de crecimiento rápido las células abuelas comiencen a replicar su ADN para la célula nieta. Por la misma razón, la iniciación de la replicación del ADN está altamente regulada. Los orígenes bacterianos regulan el ensamblaje del orisoma, un complejo de proteína-núcleo ensamblado en el origen responsable de desenrollar el origen y cargar toda la maquinaria de replicación. En E. coli, la dirección para el ensamblaje del orisoma está incorporada en un tramo corto de secuencia de nucleótidos llamado origen de replicación ( oriC ) que contiene múltiples sitios de unión para la proteína iniciadora DnaA [6] (una proteína altamente homóloga en el reino bacteriano). DnaA tiene cuatro dominios y cada dominio es responsable de una tarea específica. [7] Hay 11 sitios/cajas de unión de DnaA en el origen de replicación de E. coli [6] de las cuales tres cajas R1, R2 y R4 (que tienen una secuencia de consenso de 9 pb altamente conservada 5' - TTATC/ACACA [2] ) son cajas de DnaA de alta afinidad. Se unen a DnaA-ADP y DnaA-ATP con afinidades iguales y están unidas por DnaA durante la mayor parte del ciclo celular y forman un andamio en el que se ensambla el resto del orisoma. Las ocho cajas de DnaA restantes son sitios de baja afinidad que se unen preferentemente a DnaA-ATP. [6] Durante la iniciación, DnaA unida a la caja de DnaA de alta afinidad R4 dona DnaA adicional al sitio de baja afinidad adyacente y llena progresivamente todas las cajas de DnaA de baja afinidad. [6] El llenado de los sitios cambia la conformación del origen de su estado nativo. Se ha planteado la hipótesis de que el estiramiento del ADN por el DnaA unido al origen promueve la separación de las cadenas, lo que permite que más DnaA se una a la región desenrollada. [8] El cargador de helicasa DnaC interactúa entonces con el DnaA unido al ADN monocatenario para reclutar la helicasa DnaB , [9] que continuará desenrollando el ADN a medida que la primasa DnaG establece un cebador de ARN y la holoenzima ADN polimerasa III comienza la elongación. [10]
La replicación cromosómica en bacterias está regulada en la etapa de iniciación. [2] El DnaA-ATP se hidroliza en el DnaA-ADP inactivo por RIDA (Inactivación Reguladora de DnaA), [11] y se convierte nuevamente a la forma activa de DnaA-ATP por DARS (Secuencia Reactivadora de DnaA, que a su vez está regulada por Fis e IHF). [12] [13] Sin embargo, la principal fuente de DnaA-ATP es la síntesis de nuevas moléculas. [2] Mientras tanto, varias otras proteínas interactúan directamente con la secuencia oriC para regular la iniciación, generalmente por inhibición. En E. coli, estas proteínas incluyen DiaA, [14] SeqA , [15] IciA, [2] HU, [9] y ArcA-P, [2] pero varían entre otras especies bacterianas. Algunos otros mecanismos en E. coli que regulan de diversas formas la iniciación son DDAH ( hidrólisis de DnaA dependiente de datA , que también está regulada por IHF), [16] inhibición del gen dnaA (por la proteína SeqA), [2] y reactivación de DnaA por la membrana lipídica. [17]
Una vez que se completa la preparación, la holoenzima ADN polimerasa III se carga en el ADN y comienza la replicación. El mecanismo catalítico de la ADN polimerasa III implica el uso de dos iones metálicos en el sitio activo y una región en el sitio activo que puede discriminar entre desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos . Los iones metálicos son cationes divalentes generales que ayudan al 3' OH a iniciar un ataque nucleofílico sobre el fosfato alfa del desoxirribonucleótido y orientar y estabilizar el trifosfato cargado negativamente en el desoxirribonucleótido. El ataque nucleofílico del 3' OH sobre el fosfato alfa libera pirofosfato , que luego se hidroliza posteriormente (por la fosfatasa inorgánica) en dos fosfatos. Esta hidrólisis impulsa la síntesis de ADN hasta su finalización.
Además, la ADN polimerasa III debe ser capaz de distinguir entre bases correctamente emparejadas y bases incorrectamente emparejadas. Esto se logra distinguiendo pares de bases Watson-Crick mediante el uso de un bolsillo del sitio activo que es complementario en forma a la estructura de nucleótidos correctamente emparejados. Este bolsillo tiene un residuo de tirosina que es capaz de formar interacciones de van der Waals con el nucleótido correctamente emparejado. Además, el dsADN ( ADN bicatenario ) en el sitio activo tiene un surco mayor más ancho y un surco menor menos profundo que permite la formación de enlaces de hidrógeno con el tercer nitrógeno de las bases de purina y el segundo oxígeno de las bases de pirimidina . Finalmente, el sitio activo hace enlaces de hidrógeno extensos con la estructura principal del ADN. Estas interacciones dan como resultado que la ADN polimerasa III se cierre alrededor de una base correctamente emparejada. Si se inserta una base y se empareja incorrectamente, estas interacciones no podrían ocurrir debido a interrupciones en los enlaces de hidrógeno y las interacciones de van der Waals.
El ADN se lee en la dirección 3' → 5', por lo tanto, los nucleótidos se sintetizan (o se unen a la cadena molde ) en la dirección 5' → 3'. Sin embargo, una de las cadenas parentales del ADN está 3' → 5' mientras que la otra está 5' → 3'. Para solucionar esto, la replicación ocurre en direcciones opuestas. Dirigiéndose hacia la horquilla de replicación, la cadena líder se sintetiza de manera continua, requiriendo solo un cebador. Por otro lado, la cadena rezagada , que se aleja de la horquilla de replicación, se sintetiza en una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki, requiriendo en consecuencia muchos cebadores. Los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki son posteriormente degradados por la ARNasa H y la ADN polimerasa I ( exonucleasa ), y los huecos (o mellas ) se rellenan con desoxirribonucleótidos y se sellan mediante la enzima ligasa .
La tasa de replicación del ADN en una célula viva se midió por primera vez como la tasa de elongación del ADN del fago T4 en E. coli infectada con fagos. [18] Durante el período de aumento exponencial del ADN a 37 °C, la tasa fue de 749 nucleótidos por segundo. La tasa de mutación por par de bases por replicación durante la síntesis del ADN del fago T4 es de 1,7 por 10 8 . [19]
La terminación de la replicación del ADN en E. coli se completa mediante el uso de secuencias de terminación y la proteína Tus . Estas secuencias permiten que las dos horquillas de replicación pasen en una sola dirección, pero no en la otra.
La replicación del ADN produce inicialmente dos dúplex de ADN circulares encadenados o ligados, cada uno de los cuales comprende una cadena parental y una cadena recién sintetizada (por la naturaleza de la replicación semiconservativa ). Esta encadenación se puede visualizar como dos anillos interconectados que no se pueden separar. La topoisomerasa 2 en E. coli desenlaza o descatena los dos dúplex de ADN circulares rompiendo los enlaces fosfodiéster presentes en dos nucleótidos sucesivos del ADN parental o del ADN recién formado y, a continuación, la actividad de ligadura liga esa cadena de ADN rota y, así, se forman los dos ADN.
Ya se ha mencionado la replicación de tipo theta. Existen otros tipos de replicación procariota, como la replicación de círculo rodante y la replicación de bucle D.
Esto se observa en la conjugación bacteriana , donde el mismo ADN de plantilla circular gira y alrededor de él se desarrolla la nueva cadena.
. Cuando la conjugación se inicia mediante una señal, la enzima relaxasa crea una muesca en una de las hebras del plásmido conjugativo en el oriT . La relaxasa puede funcionar sola o en un complejo de más de una docena de proteínas conocidas colectivamente como relaxosoma . En el sistema del plásmido F, la enzima relaxasa se llama TraI y el relaxosoma consta de TraI, TraY, TraM y el factor huésped integrado IHF. La hebra mellada, o hebra T , se desenrolla luego de la hebra intacta y se transfiere a la célula receptora en una dirección del extremo 5' al extremo 3'. La hebra restante se replica independientemente de la acción conjugativa (replicación vegetativa que comienza en el oriV ) o en conjunto con la conjugación (replicación conjugativa similar a la replicación de círculo rodante del fago lambda ). La replicación conjugativa puede requerir una segunda muesca antes de que pueda ocurrir una transferencia exitosa. Un informe reciente afirma haber inhibido la conjugación con sustancias químicas que imitan un paso intermedio de este segundo evento de mellado. [20]
La replicación del bucle D se observa principalmente en el ADN organelar, donde se forma una estructura de triple cadena llamada bucle de desplazamiento . [21]