Imágenes de fluorescencia

Tipo de técnica de imagen no invasiva

Imagen de fluorescencia multicolor de células HeLa vivas

La obtención de imágenes por fluorescencia es un tipo de técnica de obtención de imágenes no invasiva que puede ayudar a visualizar los procesos biológicos que tienen lugar en un organismo vivo. Las imágenes se pueden generar a partir de una variedad de métodos, entre ellos: microscopía , sondas de obtención de imágenes y espectroscopía .

La fluorescencia en sí es una forma de luminiscencia que resulta de la materia que emite luz de una determinada longitud de onda después de absorber radiación electromagnética . Las moléculas que reemiten luz tras la absorción de luz se denominan fluoróforos . ^{[1] [2]}

La obtención de imágenes por fluorescencia fotografía colorantes y proteínas fluorescentes para marcar mecanismos y estructuras moleculares. Permite observar experimentalmente la dinámica de la expresión génica , la expresión proteica y las interacciones moleculares en una célula viva. ^[3] Básicamente, sirve como una herramienta cuantitativa y precisa para aplicaciones bioquímicas.

Un error muy común es que la fluorescencia se diferencia de la bioluminiscencia en la forma en que las proteínas de cada proceso producen luz. La bioluminiscencia es un proceso químico en el que las enzimas descomponen un sustrato para producir luz. La fluorescencia es la excitación física de un electrón y su posterior retorno para emitir luz.

Atributos

Mecanismo de fluorescencia

Diagrama que muestra la conexión entre la absorción y la fluorescencia.

Cuando una determinada molécula absorbe luz, la energía de la molécula se eleva brevemente a un estado excitado superior. El retorno posterior al estado fundamental produce la emisión de luz fluorescente que se puede detectar y medir. La luz emitida, resultante del fotón absorbido de energía hv , tiene una longitud de onda específica. Es importante conocer esta longitud de onda de antemano para que, cuando se esté realizando un experimento, el dispositivo de medición sepa qué longitud de onda debe establecerse para detectar la producción de luz. Esta longitud de onda se determina mediante la ecuación:

${\displaystyle \lambda _{\text{emission}}=\ {\frac {hc}{{Energy}_{\text{emission}}}}}$

donde h = la constante de Planck y c = la velocidad de la luz. Normalmente, se utiliza un dispositivo de escaneo de gran tamaño o CCD para medir la intensidad y fotografiar digitalmente una imagen. ^[1]

Colorantes fluorescentes versus proteínas

Los colorantes fluorescentes, sin tiempo de maduración, ofrecen una mayor fotoestabilidad y luminosidad en comparación con las proteínas fluorescentes. En términos de luminosidad, la luminosidad depende del coeficiente de extinción de los fluoróforos o su capacidad para absorber luz, y de su eficiencia cuántica o eficacia para transformar la luz absorbida en luminiscencia que emite fluorescencia. Los colorantes en sí no son muy fluorescentes, pero cuando se unen a las proteínas, se vuelven más fácilmente detectables. Un ejemplo, NanoOrange, se une a las regiones de recubrimiento e hidrofóbicas de una proteína mientras es inmune a los agentes reductores. Con respecto a las proteínas, estas moléculas emitirán fluorescencia cuando absorban una longitud de onda de luz incidente específica. Un ejemplo de esto, la proteína fluorescente verde (GFP), emite fluorescencia verde cuando se expone a la luz en el rango azul a UV. Las proteínas fluorescentes son excelentes moléculas indicadoras que pueden ayudar a localizar proteínas, observar la unión de proteínas y cuantificar la expresión génica. ^[1]

Rango de imagen

Dado que algunas longitudes de onda de fluorescencia están fuera del alcance del ojo humano, se utilizan dispositivos de carga acoplada (CCD) para detectar con precisión la luz y obtener imágenes de la emisión. Esto ocurre típicamente en el rango de 300 a 800 nm. Una de las ventajas de la señalización fluorescente es que la intensidad de la luz emitida se comporta de manera bastante lineal en relación con la cantidad de moléculas fluorescentes proporcionadas. Obviamente, esto depende de que la intensidad de la luz absorbida y la longitud de onda sean constantes. En términos de la imagen real en sí, generalmente está en un formato de datos de 12 o 16 bits. ^[1]

Proteína fluorescente verde (GFP) iluminada con luz ultravioleta en tres ratones de laboratorio

Sistemas de imágenes

Los componentes principales de los sistemas de imágenes de fluorescencia son:

• Fuente de excitación: dispositivo que produce una fuente de longitud de onda amplia, como la luz ultravioleta, o una fuente de longitud de onda estrecha, como un láser.
• Óptica de visualización de luz: mecanismo por el cual la luz ilumina la muestra. Esto se hace típicamente mediante la iluminación directa de la muestra.
• Óptica de captación de luz: método de captación de la luz en sí. Normalmente se trata de lentes, espejos y filtros.
• Filtración de la luz emitida: los filtros ópticos garantizan que la luz reflejada y dispersa no se incluya en la fluorescencia. Las tres clases de filtros de emisión son de paso largo, de paso corto y de paso de banda.
• Detección, amplificación y visualización: se utiliza un fotomultiplicador (PMT) o un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) para detectar y cuantificar los fotones emitidos.

Aplicaciones

• En la PCR (electroforesis en gel de agarosa): el SYBR Green es un colorante muy común que se une al ADN y se utiliza para visualizar bandas de ADN en un gel de agarosa. El colorante absorbe la luz azul y emite fluorescencia verde para que un sistema de imágenes la capture.
• Transferencia (Western, Northern y Southern): los fluorocromos pueden unirse a anticuerpos, ARN y ADN para emitir fluorescencia y cuantificar datos.
• Secuenciación de ADN: la secuenciación de Sanger es una forma común de detección de ácidos nucleicos que puede utilizar ddNTP marcados con fluorescencia para obtener imágenes de picos de fluorescencia.
• Cirugía guiada por imágenes de fluorescencia: es un método de diagnóstico por imágenes que marca con fluorescencia una masa para facilitar la navegación. Por ejemplo, el verde de indocianina se puede utilizar para detectar ganglios linfáticos en pacientes con cáncer. ^[4]
• Imágenes de fluorescencia con precisión de un nanómetro (FIONA): utiliza iluminación de reflexión interna total para reducir el ruido y aumentar el brillo de los fluoróforos ^[5]
• Imágenes de calcio: técnica que utiliza moléculas fluorescentes llamadas indicadores de calcio que cambian de fluorescencia cuando se unen a iones Ca ²⁺ . Esta es una parte clave para ver cuándo las células están activas en el sistema nervioso. ^[6]
• La pegulicianina (Lumisight) está indicada para la obtención de imágenes de fluorescencia en adultos con cáncer de mama como complemento para la detección intraoperatoria de tejido canceroso dentro de la cavidad de resección después de la extracción de la muestra primaria durante la cirugía de tumorectomía. ^[7]
• Microscopía de localización fotoactivada .

Gel de agarosa que utiliza bromuro de etidio como marcador fluorescente bajo iluminación de luz ultravioleta

Tipos de microscopía

Se pueden emplear diferentes técnicas de microscopio para cambiar la visualización y el contraste de una imagen. Cada método tiene sus pros y sus contras, pero todos utilizan el mismo mecanismo de fluorescencia para observar un proceso biológico.

• Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total: técnica de microscopía que utiliza ondas evanescentes para observar selectivamente la fluorescencia de una sola molécula. ^[8]
• Microscopía de fluorescencia de lámina de luz: técnica de microscopía de fluorescencia que ilumina una fina porción de una muestra en un ángulo de examen perpendicular. ^[9]
• Microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia: una técnica de imágenes que registra los cambios en la fluorescencia a lo largo del tiempo.

Ventajas

• No invasivo: la obtención de imágenes in vivo se puede realizar sin necesidad de perforar la piel.
• Sensible: las sondas están diseñadas para ser extremadamente sensibles a la detección de moléculas biológicas como ADN, ARN y proteínas. ^[1]
• Marcado múltiple: se pueden detectar múltiples fluorocromos dentro de las muestras, lo que permite una forma sencilla de integrar estándares y un control.
• Estabilidad de las moléculas marcadas: las moléculas marcadas con fluorescencia utilizadas en imágenes pueden almacenarse durante meses, mientras que otras moléculas, como las radiomarcadas, se desintegrarán en unos pocos días. ^[9]
• Relativamente seguro de manipular: la mayoría de los fluoróforos se pueden manipular de forma segura y suficiente con guantes, mientras que, por ejemplo, los radioisótopos pueden requerir protectores de plomo u otra protección radiológica. ^[9]
• Eliminación sencilla: muchos fluoróforos requieren métodos de eliminación mínimos, mientras que los desechos radiactivos requieren una eliminación regulada y una manipulación a largo plazo. Esto también ayuda a reducir el costo necesario para utilizar estos productos.

Desventajas

Ejemplo de microscopio de fluorescencia con dispositivo de carga acoplada (CCD) para capturar imágenes

• Fotoblanqueo: un problema frecuente con los fluoróforos donde el ciclo constante entre el estado fundamental y el estado excitado daña la molécula y reduce su intensidad. ^[9]
• Susceptibilidad ambiental: factores ambientales como la temperatura, la concentración de iones y el pH pueden afectar la eficiencia y la emisión de los fluorocromos.
• Toxicidad: Algunos fluorocromos pueden ser tóxicos para las células, para los tejidos, in vivo o al producir mutaciones. ^[10]
• Poder de resolución limitado: los microscopios de fluorescencia tienen una capacidad limitada para distinguir objetos cercanos a nivel macroscópico. En comparación, los microscopios electrónicos, por ejemplo, tienen la capacidad de resolver en un rango mucho menor.
• Rango de luminosidad inicial limitado: la intensidad de la fuente de luz de incidencia tiene un límite y más allá de este punto puede resultar en la fotodestrucción de moléculas. ^[1]

En general, esta forma de obtención de imágenes es extremadamente útil en la investigación de vanguardia, gracias a su capacidad para monitorear procesos biológicos. La evolución de las imágenes fluorescentes en 2D a las imágenes en 3D ha permitido a los científicos estudiar mejor la precisión y la resolución espaciales. Además, gracias a los esfuerzos concentrados en el análisis en 4D, los científicos ahora pueden monitorear una célula en tiempo real, lo que les permite monitorear procesos de acción rápida.

Direcciones futuras

Variación de colores de fluorescencia de una gama de proteínas fluorescentes.

El desarrollo de proteínas fluorescentes más eficaces es una tarea que muchos científicos han asumido con el fin de mejorar las capacidades de las sondas de obtención de imágenes. A menudo, las mutaciones en ciertos residuos pueden cambiar significativamente las propiedades fluorescentes de la proteína. Por ejemplo, al mutar el gen F64L en la GFP de las medusas, la proteína puede fluorescer de manera más eficiente a 37 °C, un atributo importante que se debe tener cuando se cultiva en un laboratorio. ^[11] Además de esto, la ingeniería genética puede producir una proteína que emita luz a una mejor longitud de onda o frecuencia. ^[11] Además, el propio entorno puede desempeñar un papel crucial. La vida útil de la fluorescencia se puede estabilizar en un entorno polar.

Los mecanismos que han sido bien descritos pero no necesariamente incorporados a aplicaciones prácticas tienen un potencial prometedor para la obtención de imágenes por fluorescencia. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es un mecanismo extremadamente sensible que produce moléculas de señalización en el rango de 1 a 10 nm. ^[8]

Las mejoras en las técnicas que constituyen los procesos de fluorescencia también son cruciales para lograr diseños más eficientes. La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una técnica de análisis que observa la fluctuación de la intensidad de la fluorescencia. Este análisis es un componente de muchas máquinas de obtención de imágenes de fluorescencia y las mejoras en la resolución espacial podrían mejorar la sensibilidad y el alcance. ^[8]

El desarrollo de sondas más sensibles y técnicas analíticas para la fluorescencia inducida por láser puede permitir obtener datos experimentales más precisos y actualizados.

Véase también

• Fluorescencia en las ciencias de la vida
• Microscopio de fluorescencia

Referencias

1. "Principios y métodos de obtención de imágenes por fluorescencia" (PDF) . Universidad de Boston . Diciembre de 2012.
2. Sirbu, Dumitru; Luli, Saimir; Leslie, Jack; Oakley, Fiona; Benniston, Andrew C. (17 de mayo de 2019). "Imágenes ópticas in vivo mejoradas de la respuesta inflamatoria a la lesión hepática aguda en ratones C57BL/6 utilizando un tinte BODIPY de infrarrojo cercano altamente brillante". ChemMedChem . 14 (10): 995–999. doi :10.1002/cmdc.201900181. ISSN  1860-7179. PMID  30920173. S2CID  85544665.
3. "Imágenes de fluorescencia: últimas investigaciones y noticias". Nature . Consultado el 18 de abril de 2019 .
4. Nagaya, Tadanobu; Nakamura, Yu A.; Choyke, Peter L.; Kobayashi, Hisataka (22 de diciembre de 2017). "Cirugía guiada por fluorescencia". Frontiers in Oncology . 7 : 314. doi : 10.3389/fonc.2017.00314 . ISSN  2234-943X. PMC 5743791 . PMID  29312886. 
5. Yildiz, Ahmet; Selvin, Paul R. (1 de julio de 2005). "Imágenes de fluorescencia con precisión de un nanómetro: aplicación a motores moleculares". Accounts of Chemical Research . 38 (7): 574–582. doi :10.1021/ar040136s. ISSN  0001-4842. PMID  16028892.
6. "Microscopía de fluorescencia: ventajas y desventajas". Centro de aprendizaje de ADN . Consultado el 18 de abril de 2019 .
7. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/appletter/2024/214511Orig1s000ltr.pdf Este artículo incorpora texto de esta fuente, que se encuentra en el dominio público .
8. Haustein, Elke; Schwille, Petra (septiembre de 2007). "Tendencias en imágenes de fluorescencia y técnicas relacionadas para desentrañar información biológica". Revista HFSP . 1 (3): 169–180. doi :10.2976/1.2778852. ISSN  1955-2068. PMC 2640989 . PMID  19404444. 
9. Forero-Shelton, Manu (abril de 2019). "Observar el interior de las células con alta resolución es ahora más fácil". Nature Methods . 16 (4): 293–294. doi :10.1038/s41592-019-0373-3. ISSN  1548-7105. PMID  30886415. S2CID  81982416.
10. Alford, Raphael; Simpson, Haley M.; Duberman, Josh; Hill, G. Craig; Ogawa, Mikako; Regino, Celeste; Kobayashi, Hisataka; Choyke, Peter L. (1 de noviembre de 2009). "Toxicidad de los fluoróforos orgánicos utilizados en imágenes moleculares: revisión de la literatura". Imágenes moleculares . 8 (6): 341–354. doi : 10.2310/7290.2009.00031 . ISSN  1536-0121. PMID  20003892.
11. Piston, David W.; Davidson, Michael W.; Cranfill, Paula J.; Gilbert, Sarah G.; Kremers, Gert-Jan (15 de enero de 2011). "Proteínas fluorescentes de un vistazo". J Cell Sci . 124 (2): 157–160. doi :10.1242/jcs.072744. ISSN  0021-9533. PMC 3037093 . PMID  21187342. 

Lectura adicional

• Yu, Jyao; Harankhedkar, Shefali; Nabatilan, Arielle; Fahrni, Christopher (2021). "Capítulo 4: Imágenes de metales traza en sistemas biológicos". En Kroneck, Peter MH; Sosa Torres, Martha (eds.). Metales, microbios y minerales: el lado biogeoquímico de la vida . Volumen 21 de la serie Iones metálicos en las ciencias de la vida. Berlín: Walter de Gruyter. págs. 81–134. doi :10.1515/9783110589771-010. ISBN 9783110589771. S2CID  240664558 (requiere suscripción) .{{cite book}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ) Mantenimiento CS1: postscript ( enlace )