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Ensayo

Un ensayo es un procedimiento investigativo (analítico) en medicina de laboratorio , minería , farmacología , biología ambiental y biología molecular para evaluar cualitativamente o medir cuantitativamente la presencia, cantidad o actividad funcional de una entidad objetivo. La entidad medida a menudo se denomina analito , mensurando o objetivo del ensayo. El analito puede ser un fármaco , una sustancia bioquímica , un elemento o compuesto químico o una célula en un organismo o una muestra orgánica . [1] [2] Un ensayo generalmente tiene como objetivo medir la propiedad intensiva de un analito y expresarla en la unidad de medida relevante (por ejemplo, molaridad , densidad , actividad funcional en unidades internacionales enzimáticas, grado de efecto en comparación con un estándar, etc.).

Si el ensayo implica reactivos exógenos (los reactivos ), entonces sus cantidades se mantienen fijas (o en exceso) de modo que la cantidad y calidad del objetivo sean los únicos factores limitantes. La diferencia en el resultado del ensayo se utiliza para deducir la calidad o cantidad desconocida del objetivo en cuestión. Algunos ensayos (por ejemplo, los ensayos bioquímicos) pueden ser similares al análisis químico y la titulación . Sin embargo, los ensayos normalmente implican material biológico o fenómenos que son intrínsecamente más complejos en composición o comportamiento, o ambos. Por lo tanto, la lectura de un ensayo puede ser ruidosa e implicar mayores dificultades de interpretación que una titulación química precisa. Por otro lado, los ensayos cualitativos de generaciones anteriores, especialmente los bioensayos , pueden ser mucho más burdos y menos cuantitativos (por ejemplo, contar la muerte o disfunción de un organismo o células en una población, o algún cambio descriptivo en alguna parte del cuerpo de un grupo de animales).

Los ensayos se han convertido en una parte rutinaria de la tecnología médica , ambiental , farmacéutica y forense moderna . Otras empresas también pueden emplearlos a nivel industrial , en la acera o en el campo. Los ensayos con alta demanda comercial han sido bien investigados en los sectores de investigación y desarrollo de las industrias profesionales. También han experimentado generaciones de desarrollo y sofisticación. En algunos casos, están protegidos por regulaciones de propiedad intelectual como patentes otorgadas para invenciones. Estos ensayos a escala industrial a menudo se realizan en laboratorios bien equipados y con una organización automatizada del procedimiento, desde el pedido de un ensayo hasta el procesamiento preanalítico de la muestra (recolección de muestras, manipulaciones necesarias, por ejemplo, centrifugado para separación , alícuotas si es necesario, almacenamiento, recuperación, pipeteo , aspiración , etc.). Los analitos generalmente se prueban en autoanalizadores de alto rendimiento y los resultados se verifican y se devuelven automáticamente a los proveedores de servicios de pedidos y a los usuarios finales . Esto es posible gracias al uso de un sistema informático de laboratorio avanzado que interactúa con múltiples terminales de computadora con usuarios finales, servidores centrales , instrumentos autoanalizadores físicos y otros autómatas. [ aclaración necesaria ]

Etimología

Según Etymology Online, [3] el verbo assay significa "probar, esforzarse, esforzarse, probar la calidad de"; del anglofrancés assaier , de assai (sustantivo), del francés antiguo essai , "ensayo". Así, el sustantivo assay significa "ensayo, prueba de calidad, prueba de carácter" (de mediados del siglo XIV), del anglofrancés assai ; y su significado "análisis" es de finales del siglo XIV.

En el caso del ensayo de monedas, esto significaba literalmente el análisis de la pureza del oro o la plata (o cualquier componente precioso) que representaba el valor real de la moneda. Esto podría haberse traducido más tarde (posiblemente después del siglo XIV) en un uso más amplio de "análisis", [ cita requerida ] por ejemplo, en farmacología, el análisis de un componente importante de un objetivo dentro de una mezcla, como el ingrediente activo de un fármaco dentro de los excipientes inertes en una fórmula que anteriormente se medía solo de manera general por su acción observable en un organismo (por ejemplo, una dosis letal o una dosis inhibidora).

Pasos generales

Un ensayo (análisis) nunca es un proceso aislado, ya que debe ir acompañado de procedimientos preanalíticos y posanalíticos. Tanto la orden de comunicación (la solicitud de realizar un ensayo más la información relacionada) como el manejo de la muestra en sí (la recolección, documentación, transporte y procesamiento realizados antes de comenzar el ensayo) son pasos preanalíticos. De manera similar, una vez finalizado el ensayo, los resultados deben documentarse, verificarse y comunicarse: los pasos posanalíticos. Como ocurre con cualquier sistema de manejo y transmisión de información de varios pasos , la variación y los errores en la notificación de los resultados finales implican no solo los intrínsecos al ensayo en sí, sino también los que ocurren en los procedimientos preanalíticos y posanalíticos.

Si bien los pasos analíticos del ensayo en sí reciben mucha atención, [4] son ​​aquellos que reciben menos atención de la cadena de usuarios (los procedimientos preanalíticos y posanalíticos) los que generalmente acumulan la mayor cantidad de errores; por ejemplo, los pasos preanalíticos en los ensayos de laboratorio médico pueden contribuir con el 32-75% de todos los errores de laboratorio. [5]

Los ensayos pueden ser muy diversos, pero generalmente implican los siguientes pasos generales:

  1. Procesamiento y manipulación de muestras para presentar selectivamente el objetivo en una forma discernible o medible a un sistema de discriminación/identificación/detección. Puede implicar una simple separación centrífuga o lavado o filtración o captura mediante alguna forma de unión selectiva o incluso puede implicar la modificación del objetivo, por ejemplo, la recuperación de epítopos en ensayos inmunológicos o el corte del objetivo en pedazos, por ejemplo, en espectrometría de masas . Generalmente, se realizan múltiples pasos separados antes de un ensayo y se denominan procesamiento preanalítico. Pero algunas de las manipulaciones pueden ser parte inseparable del ensayo en sí y, por lo tanto, no se considerarán preanalíticas.
  2. Principio de discriminación/identificación específica del objetivo : discriminar del fondo (ruido) de componentes similares e identificar específicamente un componente objetivo particular ("analito") en un material biológico por sus atributos específicos. (por ejemplo, en un ensayo de PCR , un cebador oligonucleótido específico identifica el objetivo por apareamiento de bases basado en la secuencia de nucleótidos específica exclusiva del objetivo).
  3. Sistema de amplificación de la señal (o del objetivo) : la presencia y cantidad de ese analito se convierte en una señal detectable que generalmente implica algún método de amplificación de la señal, de modo que se pueda distinguir fácilmente del ruido y medir; por ejemplo, en un ensayo de PCR entre una mezcla de secuencias de ADN, solo el objetivo específico se amplifica en millones de copias mediante una enzima ADN polimerasa de modo que se pueda discernir como un componente más destacado en comparación con cualquier otro componente potencial. A veces, la concentración del analito es demasiado grande y, en ese caso, el ensayo puede implicar la dilución de la muestra o algún tipo de sistema de disminución de la señal, que es una amplificación negativa.
  4. Sistema de detección (e interpretación) de señales : sistema que permite descifrar la señal amplificada y convertirla en una salida interpretable que puede ser cuantitativa o cualitativa. Puede tratarse de métodos visuales o manuales muy rudimentarios o de detectores electrónicos digitales o analógicos muy sofisticados.
  5. La mejora de la señal y el filtrado de ruido se pueden realizar en cualquiera o en todos los pasos anteriores. Dado que cuanto más avanzado sea un paso o proceso durante un ensayo, mayor será la probabilidad de que se transmita ruido del proceso anterior y se amplifique, los pasos múltiples de un ensayo sofisticado pueden implicar varios medios de configuración de mejora o nitidez de la señal y de configuración de filtrado o reducción de ruido. Estos pueden ser simplemente en forma de un filtro óptico de paso de banda estrecha , o un reactivo de bloqueo en una reacción de unión que evita la unión no específica o un reactivo de extinción en un sistema de detección de fluorescencia que evita la "autofluorescencia" de los objetos de fondo. [ cita requerida ]

Tipos de ensayo según la naturaleza del proceso de ensayo

Hora y número de mediciones realizadas

Dependiendo de si un ensayo solo analiza un único punto de tiempo o lecturas cronometradas tomadas en múltiples puntos de tiempo, un ensayo puede ser:

  1. Un ensayo de punto final , en el que se realiza una única medición después de un período de incubación fijo; o
  2. Un ensayo cinético , en el que se realizan mediciones varias veces durante un intervalo de tiempo fijo. Los resultados del ensayo cinético se pueden visualizar numéricamente (por ejemplo, como un parámetro de pendiente que representa la tasa de cambio de la señal a lo largo del tiempo) o gráficamente (por ejemplo, como un gráfico de la señal medida en cada punto temporal). En los ensayos cinéticos, tanto la magnitud como la forma de la respuesta medida a lo largo del tiempo proporcionan información importante.
  3. Un ensayo de alto rendimiento puede ser un ensayo de punto final o un ensayo cinético que generalmente se realiza en una plataforma automatizada en formatos de microplacas de 96, 384 o 1536 pocillos ( High Throughput Screening ). Dichos ensayos pueden probar una gran cantidad de compuestos o analitos o realizar lecturas biológicas funcionales en respuesta a un estímulo o compuestos que se están probando. [6]

Número de analitos detectados

Dependiendo de cuántos objetivos o analitos se estén midiendo:

  1. Los ensayos habituales son ensayos simples o de objetivo único , que suelen ser los predeterminados, a menos que se denominen multiplex.
  2. Los ensayos multiplex se utilizan para medir simultáneamente la presencia, concentración, actividad o calidad de múltiples analitos en una sola prueba. La aparición de la multiplexación permitió realizar pruebas de muestras rápidas y eficientes en muchos campos, entre ellos la inmunología, la citoquímica, la genética/genómica, la farmacocinética y la toxicología. [7]

Tipo de resultado

Dependiendo de la calidad del resultado obtenido, los ensayos pueden clasificarse en:

  1. Ensayos cualitativos , es decir, ensayos que generalmente dan solo un aprobado o reprobado, o positivo o negativo o algún tipo de gradación cualitativa en lugar de una cantidad exacta.
  2. Ensayos semicuantitativos , es decir, ensayos que dan la lectura de manera aproximada en lugar de un número exacto de la cantidad de la sustancia. Generalmente tienen algunas gradaciones más que solo dos resultados, positivo o negativo, por ejemplo, la puntuación en una escala de 1+ a 4+ como la que se usa para las pruebas de agrupamiento sanguíneo basadas en la aglutinación de glóbulos rojos en respuesta a reactivos de agrupamiento (anticuerpos contra antígenos del grupo sanguíneo).
  3. Ensayos cuantitativos , es decir, ensayos que brindan una medida cuantitativa numérica precisa y exacta de la cantidad de una sustancia en una muestra. Un ejemplo de un ensayo de este tipo utilizado en laboratorios de pruebas de coagulación para la enfermedad hemorrágica hereditaria más común, la enfermedad de von Willebrand , es el ensayo de antígeno VWF , en el que se mide la cantidad de VWF presente en una muestra de sangre mediante un inmunoensayo.
  4. Ensayos funcionales , es decir, un ensayo que intenta cuantificar el funcionamiento de una sustancia activa en lugar de solo su cantidad. La contraparte funcional del ensayo del antígeno VWF es el ensayo del cofactor de ristocetina , que mide la actividad funcional del VWF presente en el plasma de un paciente agregando plaquetas fijadas con formalina exógena y cantidades gradualmente crecientes del fármaco llamado ristocetina mientras se mide la aglutinación de las plaquetas fijadas. Un ensayo similar pero utilizado para un propósito diferente se llama agregación plaquetaria inducida por ristocetina o RIPA, que prueba la respuesta de las plaquetas vivas endógenas de un paciente en respuesta a la ristocetina (exógena) y al VWF (generalmente endógeno).

Tipo de muestra y método

Dependiendo del sustrato general sobre el que se aplica el principio de ensayo:

  1. Bioensayo : cuando la respuesta es la actividad biológica de objetos vivos. Algunos ejemplos incluyen
    1. in vivo , organismo completo (por ejemplo, ratón u otro sujeto al que se le inyecta un fármaco)
    2. Parte del cuerpo ex vivo (por ejemplo, la pata de una rana)
    3. órgano ex vivo (por ejemplo, el corazón de un perro)
    4. parte ex vivo de un órgano (por ejemplo, un segmento de intestino).
    5. tejido (por ejemplo, lisado de limulus)
    6. célula (por ejemplo, plaquetas)
  2. Ensayo de unión de ligando cuando un ligando (generalmente una molécula pequeña) se une a un receptor (generalmente una proteína grande).
  3. Inmunoensayo cuando la respuesta es una reacción de tipo unión antígeno-anticuerpo.

Amplificación de señal

Dependiendo de la naturaleza del sistema de amplificación de señal, los ensayos pueden ser de numerosos tipos, por nombrar algunos:

  1. Ensayo enzimático : las enzimas pueden probarse por su actividad altamente repetitiva en una gran cantidad de sustratos cuando la pérdida de un sustrato o la fabricación de un producto puede tener un atributo medible como el color o la absorbancia en una longitud de onda o luz particular o electroquimioluminiscencia o actividad eléctrica/redox.
  2. Sistemas de detección de luz que pueden utilizar amplificación, por ejemplo, mediante un fotodiodo o un tubo fotomultiplicador o un dispositivo acoplado por carga enfriado .
  3. Los sustratos marcados con radioisótopos se utilizan en radioinmunoensayos y ensayos de diálisis de equilibrio y se pueden detectar mediante la amplificación en contadores gamma o placas de rayos X, o en un fosfoimager.
  4. Ensayos de reacción en cadena de la polimerasa que amplifican un objetivo de ADN (o ARN) en lugar de la señal
  5. Métodos de combinación Los ensayos pueden utilizar una combinación de los métodos de amplificación anteriores y otros para mejorar la sensibilidad, por ejemplo, inmunoensayo ligado a enzimas o EIA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas .

Método o tecnología de detección

Dependiendo de la naturaleza del sistema de detección, los ensayos pueden basarse en:

  1. Formación de colonias o recuento de colonias virtuales : por ejemplo, mediante la multiplicación de bacterias o la proliferación de células.
  2. Fotometría / espectrofotometría Cuando se mide la absorbancia de una longitud de onda específica de luz al pasar a través de una longitud de trayectoria fija a través de una cubeta de muestra de prueba líquida y la absorbancia se compara con un blanco y estándares con cantidades graduadas del compuesto objetivo. Si la luz emitida es de una longitud de onda visible específica, puede llamarse colorimetría , o puede implicar una longitud de onda específica de luz, por ejemplo, mediante el uso de láser y la emisión de señales fluorescentes de otra longitud de onda específica que se detecta a través de filtros ópticos de longitud de onda muy específica.
  3. La transmitancia de luz se puede utilizar para medir, por ejemplo, la eliminación de la opacidad de un líquido creada por partículas suspendidas debido a la disminución del número de grumos durante una reacción de aglutinación de plaquetas .
  4. Turbidimetría , cuando la opacidad de la luz transmitida directamente que pasa a través de una muestra líquida se mide mediante detectores colocados directamente frente a la fuente de luz.
  5. Nefelometría , donde se utiliza una medición de la cantidad de dispersión de luz que ocurre cuando un haz de luz pasa a través de la solución para determinar el tamaño y/o la concentración y/o la distribución del tamaño de las partículas en la muestra. [8]
  6. Reflectometría Cuando se evalúa el color de la luz reflejada desde una muestra (generalmente seca) o un reactivo, por ejemplo, las lecturas automatizadas de los ensayos con tiras reactivas para orina.
  7. Mediciones viscoelásticas, por ejemplo, viscosimetría, elastografía (por ejemplo, tromboelastografía ).
  8. Ensayos de conteo: por ejemplo, contadores de células o partículas citométricos de flujo óptico, o contadores de células basados ​​en el principio de impedancia/ coulter
  9. Ensayos de imágenes, que implican el análisis de imágenes de forma manual o mediante software:
    1. Citometría : Cuando las estadísticas del tamaño de las células se evalúan mediante un procesador de imágenes.
  10. La detección eléctrica, por ejemplo mediante amperometría , voltamperometría o culombimetría , se puede utilizar directa o indirectamente para muchos tipos de mediciones cuantitativas.
  11. Se pueden utilizar otros ensayos basados ​​en propiedades físicas
    1. Osmómetro
    2. Viscosímetro
    3. Electrodos selectivos de iones
    4. Pruebas sindrómicas

Tipos de ensayos basados ​​en los objetivos que se miden

ADN

Los ensayos para estudiar las interacciones de las proteínas con el ADN incluyen:

Proteína

ARN

Ensayos de recuento celular, viabilidad, proliferación o citotoxicidad.

Un ensayo de recuento de células puede determinar la cantidad de células vivas, la cantidad de células muertas o la proporción de un tipo de célula con respecto a otro, como enumerar y tipificar glóbulos rojos frente a diferentes tipos de glóbulos blancos . Esto se mide mediante diferentes métodos físicos (transmisión de luz, cambio de corriente eléctrica). Pero otros métodos utilizan el sondeo bioquímico de la estructura o fisiología celular (tinciones). Otra aplicación es el seguimiento de cultivos celulares ( ensayos de proliferación celular o citotoxicidad ). Un ensayo de citotoxicidad mide la toxicidad de un compuesto químico para las células.

Contaminantes ambientales o alimentarios

Surfactantes

Otros ensayos celulares

Se han desarrollado muchos ensayos celulares para evaluar parámetros específicos o la respuesta de las células ( biomarcadores , fisiología celular). Las técnicas utilizadas para estudiar las células incluyen:

Ensayo de metástasis

Petroquímica

Virología

El ensayo de titulación viral basado en HPCE utiliza un sistema patentado de electroforesis capilar de alto rendimiento para determinar el título de baculovirus .

El ensayo Trofile se utiliza para determinar el tropismo del VIH .

El ensayo de placa viral consiste en calcular el número de virus presentes en una muestra. En esta técnica se cuenta el número de placas virales formadas por un inóculo viral, a partir de lo cual se puede determinar la concentración real de virus.

Secreciones celulares

Mediante la técnica ELISA se puede detectar una amplia gama de secreciones celulares (por ejemplo, un anticuerpo o una citocina específicos) . La cantidad de células que secretan esas sustancias específicas se puede determinar mediante una técnica relacionada, el ensayo ELISPOT .

Drogas

Calidad

Cuando varios ensayos miden el mismo objetivo, sus resultados y utilidad pueden o no ser comparables dependiendo de la naturaleza del ensayo y su metodología, confiabilidad, etc. Tales comparaciones son posibles a través del estudio de los atributos generales de calidad de los ensayos, por ejemplo, principios de medición (incluyendo identificación, amplificación y detección), rango dinámico de detección (usualmente el rango de linealidad de la curva estándar ), sensibilidad analítica, sensibilidad funcional, especificidad analítica, valores predictivos positivos y negativos , tiempo de respuesta, es decir, tiempo que se tarda en terminar un ciclo completo desde los pasos preanalíticos hasta el final del último paso posanalítico (envío/transmisión del informe), rendimiento , es decir, número de ensayos realizados por unidad de tiempo (usualmente expresado como por hora), etc. Las organizaciones o laboratorios que realizan ensayos con fines profesionales, por ejemplo, diagnóstico y pronóstico médicos, análisis ambientales, procedimientos forenses, investigación y desarrollo farmacéutico, deben someterse a procedimientos de garantía de calidad bien regulados que incluyan validación de métodos, calibración regular , control de calidad analítico , pruebas de competencia, acreditación de pruebas , licencias de pruebas y deben documentar las certificaciones apropiadas de la autoridad reguladora pertinente. organismos con el fin de establecer la fiabilidad de sus ensayos, especialmente para seguir siendo legalmente aceptables y responsables de la calidad de los resultados de los ensayos y también para convencer a los clientes de utilizar sus ensayos de forma comercial/profesional.

Lista de bases de datos de BioAssay

Bases de datos de bioactividad

Las bases de datos de bioactividad correlacionan estructuras u otra información química con resultados de bioactividad tomados de bioensayos en literatura, patentes y programas de detección.

Bases de datos de protocolos

Las bases de datos de protocolos correlacionan los resultados de los bioensayos con sus metadatos sobre las condiciones experimentales y los diseños de protocolos.

Véase también

Referencias

  1. ^ Diccionario de la herencia americana del idioma inglés (4.ª ed.). Boston, MA: Houghton Mifflin. 2006. ISBN 9780618701735.
  2. ^ Abate, Frank (2001). J. Jewell, Elizabeth (ed.). El nuevo diccionario americano de Oxford (2.ª ed.). Oxford: Oxford University Press. ISBN 9780195112276.
  3. ^ "Diccionario de etimología en línea - Ensayo". etymonline . Douglas Harper. 2016 . Consultado el 13 de agosto de 2016 .
  4. ^ Bonini, P; Plebani, M; Ceriotti, F; Rubboli, F (mayo de 2002). "Errores en medicina de laboratorio". Química clínica . 48 (5): 691–8. doi : 10.1093/clinchem/48.5.691 . PMID  11978595.
  5. ^ Hammerling, Julie A. (1 de febrero de 2012). "Una revisión de los errores médicos en los diagnósticos de laboratorio y dónde nos encontramos hoy: Tabla 1". Medicina de laboratorio . 43 (2): 41–44. doi : 10.1309/LM6ER9WJR1IHQAUY .
  6. ^ Sittampalam, GS (2004). "Assay Guidance Manual [Internet]". ncbi.nlm.com . Eli Lilly & Company y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales . Consultado el 12 de agosto de 2016 .
  7. ^ Banks, Peter (7 de junio de 2010). "Multiplexed Assays in the Life Sciences". biotek.com . BioTek Instruments Inc . Consultado el 13 de agosto de 2016 .
  8. ^ "Nefelometría". Diccionario Libre . Farlex. 2016. Consultado el 9 de septiembre de 2016 .
  9. ^ Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (noviembre de 1951). "Medición de proteínas con el reactivo de fenol Folin". J. Biol. Chem . 193 (1): 265–75. doi : 10.1016/S0021-9258(19)52451-6 . PMID  14907713.
  10. ^ Harris, JB (2019). "Posprocesamiento de grandes datos de bioactividad". Bioinformática y descubrimiento de fármacos . Métodos en biología molecular. Vol. 1939. págs. 37–47. doi :10.1007/978-1-4939-9089-4_3. ISBN 978-1-4939-9088-7. Número de identificación personal  30848455. Número de identificación personal  73493315.
  11. ^ ab Wang, Yanli; Bryant, Stephen H.; Cheng, Tiejun; Wang, Jiyao; Gindulyte, Asta; Shoemaker, Benjamin A.; Thiessen, Paul A.; He, Siqian; Zhang, Jian (4 de enero de 2017). "PubChem BioAssay: actualización de 2017". Nucleic Acids Research . 45 (D1): D955–D963. doi :10.1093/nar/gkw1118. PMC 5210581 . PMID  27899599. 
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Enlaces externos