El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico para evaluar la actividad metabólica celular. [1] [2] Las enzimas oxidorreductasas celulares dependientes de NAD(P)H pueden, en condiciones definidas, reflejar la cantidad de células viables presentes. Estas enzimas son capaces de reducir el colorante de tetrazolio MTT, que es químicamente bromuro de 3-(4,5 - dimetiltiazol - 2-il)-2,5- difeniltetrazolio , a su formazán insoluble, que tiene un color púrpura. Otros colorantes de tetrazolio estrechamente relacionados, incluidos XTT, MTS y los WST, se utilizan junto con el aceptor de electrones intermedio, metosulfato de 1-metoxifenazina (PMS). Con WST-1, que es impermeable a las células, la reducción ocurre fuera de la célula a través del transporte de electrones de la membrana plasmática. [3] Sin embargo, esta explicación tradicionalmente asumida es actualmente discutida ya que también se han encontrado pruebas de reducción de MTT a formazán en estructuras celulares lipídicas sin participación aparente de oxidorreductasas. [4]
Los ensayos con colorante de tetrazolio también se pueden utilizar para medir la citotoxicidad (pérdida de células viables) o la actividad citostática (cambio de proliferación a inactividad) de posibles agentes medicinales y materiales tóxicos. Los ensayos de MTT se realizan generalmente en la oscuridad, ya que el reactivo MTT es sensible a la luz. [5] [6] [7]
El MTT , un tetrazol amarillo , se reduce a formazán púrpura en las células vivas. [8] Se añade una solución de solubilización (normalmente dimetilsulfóxido , una solución de etanol acidificado o una solución del detergente dodecilsulfato de sodio en ácido clorhídrico diluido ) para disolver el producto insoluble de formazán púrpura en una solución coloreada. La absorbancia de esta solución coloreada se puede cuantificar midiendo a una determinada longitud de onda (normalmente entre 500 y 600 nm) con un espectrofotómetro . El grado de absorción de la luz depende del grado de concentración de formazán acumulado dentro de la célula y en la superficie celular. Cuanto mayor sea la concentración de formazán, más profundo será el color púrpura y, por tanto, mayor será la absorbancia.
Se ha propuesto que el XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida) reemplace al MTT, lo que produce una mayor sensibilidad y un rango dinámico más alto. El colorante de formazán formado es soluble en agua, lo que evita un paso de solubilización final. [9]
Las sales de tetrazolio solubles en agua son alternativas más recientes al MTT: se desarrollaron introduciendo cargas positivas o negativas y grupos hidroxilo en el anillo de fenilo de la sal de tetrazolio, o mejor con grupos sulfonato añadidos directa o indirectamente al anillo de fenilo.
El MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio), en presencia de metosulfato de fenazina ( PMS ), produce un producto de formazán que tiene una absorbancia máxima a 490 nm en solución salina tamponada con fosfato. El ensayo MTS a menudo se describe como un ensayo MTT "de un solo paso", que ofrece la comodidad de agregar el reactivo directamente al cultivo celular sin los pasos intermitentes requeridos en el ensayo MTT. Sin embargo, esta conveniencia hace que el ensayo MTS sea susceptible a la interferencia colorimétrica ya que los pasos intermitentes en el ensayo MTT eliminan trazas de compuestos coloreados, mientras que estos permanecen en la placa de microtitulación en el ensayo MTS de un solo paso. Se necesitan precauciones para garantizar la precisión al usar este ensayo y existen fuertes argumentos para confirmar los resultados de MTS usando observaciones cualitativas bajo un microscopio. (Esto, sin embargo, es prudente para todos los ensayos colorimétricos). [10]
Las WST (sales de tetrazolio solubles en agua) son una serie de otros colorantes solubles en agua para ensayos de MTT, desarrollados para dar diferentes espectros de absorción de los formazanos formados. [11] La WST-1 y en particular la WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio), son ventajosas sobre la MTT en que se reducen fuera de las células, se combinan con el mediador electrónico PMS y producen un formazán soluble en agua. Finalmente, los ensayos de WST (1) se pueden leer directamente (a diferencia de la MTT que necesita un paso de solubilización), (2) dan una señal más efectiva que la MTT y (3) disminuyen la toxicidad para las células (a diferencia de la MTT permeable a las células y su formazán insoluble que se acumula dentro de las células). [11]
En general, se supone que la reducción del colorante de tetrazolio depende de las enzimas oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H en gran medida en el compartimento citosólico de la célula. [3] [12] Por lo tanto, la reducción de MTT y otros colorantes de tetrazolio depende de la actividad metabólica celular debido al flujo de NAD(P)H. Las células con un metabolismo bajo, como los timocitos y los esplenocitos, reducen muy poco MTT. Por el contrario, las células que se dividen rápidamente muestran altas tasas de reducción de MTT. Es importante tener en cuenta que las condiciones del ensayo pueden alterar la actividad metabólica y, por lo tanto, la reducción del colorante de tetrazolio sin afectar la viabilidad celular. [13] Además, el mecanismo de reducción de los colorantes de tetrazolio, es decir, intracelular (MTT, MTS) frente a extracelular (WST-1), también determinará la cantidad de producto. Además, se ha proporcionado prueba de la reducción espontánea de MTT en compartimentos/estructuras celulares lipídicas, sin catálisis enzimática involucrada. [4] Sin embargo, incluso bajo este paradigma alternativo, el ensayo MTT todavía evalúa el potencial de reducción de una célula (es decir, la disponibilidad de compuestos reductores para impulsar la energética celular). [2] Como tal, la interpretación final de la viabilidad celular permanece sin cambios.
Al estudiar la viabilidad de las células sembradas en andamios fibrosos 3D, el espesor de los andamios puede influir en los resultados del ensayo MTT. [14]
La densidad óptica (DO) a 550 nm se utiliza para calcular el porcentaje de resultados de viabilidad utilizando la siguiente ecuación: [15]
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