Ensayo de viabilidad

Ensayo creado para determinar la supervivencia de órganos, células o tejidos.

Este ensayo de viabilidad en placa mide la viabilidad de varias levaduras mediante un método llamado "frogging". La investigación se lleva a cabo mediante técnicas de inoculación por goteo. Desde entonces se han llevado a cabo investigaciones sobre el "tadpoling", que es una variación del "frogging" que se lleva a cabo manteniendo las células de prueba diluidas en líquido durante todo el examen. ^[1]

Un ensayo de viabilidad es un ensayo que se crea para determinar la capacidad de los órganos , células o tejidos para mantener o recuperar un estado de supervivencia. ^[2] La viabilidad se puede distinguir de los estados de todo o nada de vida y muerte mediante el uso de un índice cuantificable que varía entre los números enteros de 0 y 1 o, si se entiende más fácilmente, el rango de 0% y 100%. ^[3] La viabilidad se puede observar a través de las propiedades físicas de las células, tejidos y órganos. Algunas de estas incluyen la actividad mecánica, la motilidad, como con los espermatozoides y los granulocitos , la contracción del tejido muscular o las células, la actividad mitótica en las funciones celulares y más. ^[3] Los ensayos de viabilidad proporcionan una base más precisa para la medición del nivel de vitalidad de un organismo.

Los ensayos de viabilidad pueden dar lugar a más hallazgos que la diferencia entre seres vivos y no vivos. Estas técnicas se pueden utilizar para evaluar el éxito de las técnicas de cultivo celular , las técnicas de criopreservación , la toxicidad de las sustancias o la eficacia de las sustancias para mitigar los efectos de las sustancias tóxicas. ^[4]

Métodos comunes

Aunque las técnicas visuales sencillas para observar la viabilidad pueden ser útiles, puede resultar difícil medir con precisión la viabilidad de un organismo o de una parte de él simplemente observando las propiedades físicas. Sin embargo, existen diversos protocolos comunes que se utilizan para observar con mayor detalle la viabilidad mediante ensayos.

• Reducción de tetrazolio: una forma útil de localizar y medir la viabilidad es realizar un ensayo de reducción de tetrazolio. El aspecto de tetrazolio de este ensayo, que utiliza cargas tanto positivas como negativas en su fórmula, promueve la distinción de la viabilidad celular en una muestra. ^[5]

• Reducción de resazurina: los ensayos de reducción de resazurina funcionan de manera muy similar a un ensayo de tetrazolio, excepto que utilizan el poder redox para alimentar su capacidad de representar la viabilidad celular. ^[5]

• Marcador de viabilidad de la proteasa: se puede observar la función de la proteasa en muestras si se desea determinar la viabilidad de las células; esta práctica en la investigación se conoce como "Concepto de ensayo de marcador de viabilidad de la proteasa". Las acciones de la proteasa cesan una vez que muere una célula, por lo que se traza una línea clara para determinar la viabilidad celular cuando se utiliza esta técnica. ^[5]

• ATP: El ATP es una molécula energética común que muchos investigadores conocen en profundidad, por lo que se aplica a la forma en que se entienden los ensayos de viabilidad. El concepto de ensayo de ATP es una técnica bien conocida para determinar la viabilidad de las células mediante la evaluación del ATP y un método conocido como "luciferasa de luciérnaga". ^[5]

• Relación sodio-potasio: Otro tipo de ensayo consiste en examinar la relación entre potasio y sodio en las células para que sirva como índice de viabilidad. Si las células no tienen un alto nivel de potasio intracelular y el sodio intracelular es bajo, entonces (1) la membrana celular puede no estar intacta y/o (2) la bomba de sodio-potasio puede no estar funcionando bien. ^{[6] [7]}  

Citometría de flujo con 7-aminoactinomicina D (7-AAD), en la que una señal más baja indica células viables. Por lo tanto, este caso muestra una buena viabilidad (la viabilidad de las células en la citometría de flujo debe ser de alrededor del 95% pero no menos del 90%. ^[8] ).

• Citólisis o fuga de membrana: Esta categoría incluye el ensayo de lactato deshidrogenasa . Los ensayos como estos contienen una enzima estable común en todas las células que se puede detectar fácilmente cuando las membranas celulares ya no están intactas. Algunos ejemplos de este tipo de ensayo son el yoduro de propidio , el azul tripán y la 7-aminoactinomicina D (7-AAD).

• Actividad mitocondrial o caspasa: La resazurina y el formazán ( MTT /XTT) pueden analizarse en varias etapas del proceso de apoptosis que presagia la muerte celular.

• Funcional: Los ensayos de la función celular serán altamente específicos para los tipos de células que se están ensayando. Por ejemplo, la motilidad es un ensayo ampliamente utilizado de la función de los espermatozoides. La supervivencia de los gametos generalmente se puede utilizar para ensayar la fertilidad . Los glóbulos rojos se han ensayado en términos de deformabilidad , fragilidad osmótica , hemólisis , nivel de ATP y contenido de hemoglobina . ^[9] Para los órganos completos trasplantables , el ensayo definitivo es la capacidad de mantener la vida después del trasplante, un ensayo que no es útil para prevenir el trasplante de órganos no funcionales. ^[10]

• Genómica y proteómica: las células pueden analizarse para detectar la activación de vías de estrés utilizando microarreglos de ADN y chips de proteínas.

• Citometría de flujo: la automatización permite el análisis de miles de células por segundo. ^[11]

Al igual que con muchos tipos de ensayos de viabilidad, las medidas cuantitativas de la función fisiológica no indican si es posible reparar y recuperar el daño. ^[12] Un ensayo de la capacidad de una línea celular para adherirse y dividirse puede ser más indicativo de un daño incipiente que de la integridad de la membrana. ^[13]

Rana y renacuajo

El "Frogging" es un tipo de método de ensayo de viabilidad que utiliza una placa de agar como entorno y consiste en sembrar diluciones seriadas fijándolas después de que se han diluido en líquido. Algunas de sus limitaciones incluyen que no tiene en cuenta la viabilidad total y no es particularmente sensible a los ensayos de baja viabilidad; sin embargo, es conocido por su ritmo rápido. ^[1] El "Tadpoling", que es un método practicado después del desarrollo del "frogging", es similar al método "frogging", pero sus células de prueba se diluyen en líquido y luego se mantienen en líquido durante el proceso de examen. El método "tadpoling" se puede utilizar para medir la viabilidad del cultivo con precisión, que es lo que representa su principal diferencia del "frogging". ^[1]

Lista de métodos de ensayo de viabilidad

• Calceína AM
• Ensayo clonogénico
• Ensayo de homodímero de etidio
• Azul Evans
• Hidrólisis de diacetato de fluoresceína / Tinción con yoduro de propidio (tinción FDA/PI)
• Citometría de flujo
• Ensayos basados ​​en formazán ( MTT /XTT)
• Proteína fluorescente verde
• Lactato deshidrogenasa (LDH)
• Violeta de metilo
• Captación de rojo neutro ( tinción vital )
• Yoduro de propidio , tinción de ADN que puede diferenciar células necróticas , apoptóticas y normales .
• Resazurina
• Ensayo TUNEL

Véase también

• Citotoxicidad
• Mancha vital

Referencias

1. Welch AZ, Koshland DE (2013). "Un ensayo simple de formación de colonias en medio líquido, denominado 'renacuajo', proporciona una medida sensible de la viabilidad del cultivo de Saccharomyces cerevisiae". Levadura . 30 (12): 501–509. doi :10.1002/yea.2989. ISSN  1097-0061. PMID  24185677. S2CID  21664332.
2. Gavanji S, Bakhtari A, Famurewa AC, Othman EM (enero de 2023). "Actividad citotóxica de medicamentos a base de hierbas evaluada in vitro: una revisión". Química y biodiversidad . 20 (2): 3–27. doi : 10.1002/cbdv.202201098 . PMID  36595710. S2CID  255473013.
3. Pegg DE (1989-06-01). "Ensayos de viabilidad para células, tejidos y órganos preservados". Criobiología . 26 (3): 212–231. doi :10.1016/0011-2240(89)90016-3. ISSN  0011-2240. PMID  2743785.
4. "Descripción general de las sondas para la viabilidad celular, la proliferación celular y la función de células vivas: sección 15.1 - EE. UU." www.thermofisher.com . Consultado el 4 de marzo de 2020 .
5. Niles AL, Moravec RA, Worzella TJ, Evans NJ, Riss TL (4 de marzo de 2013). "Ensayos de detección de alto rendimiento para la evaluación de la citotoxicidad". En Steinberg P (ed.). Métodos de detección de alto rendimiento en pruebas de toxicidad . John Wiley & Sons, Inc. págs. 107–127. doi :10.1002/9781118538203.ch5. ISBN 978-1-118-53820-3.
6. Lindner B, Seydel U (enero de 1983). "Análisis espectrométrico de masas de cambios inducidos por fármacos en los contenidos de Na+ y K+ de células bacterianas individuales". Journal of General Microbiology . 129 (1): 51–5. doi : 10.1099/00221287-129-1-51 . PMID  6339677.
7. Pichugin Y, Fahy GM, Morin R (abril de 2006). "Crioconservación de cortes de hipocampo de rata mediante vitrificación". Criobiología . 52 (2): 228–40. doi :10.1016/j.cryobiol.2005.11.006. PMID  16403489.
8. "Protocolo de tinción de citometría de flujo (FACS) (tinción de la superficie celular)". Facultad de Medicina de Yale - Citometría de flujo de Yale . Consultado el 17 de octubre de 2023 .
9. Henkelman S, Lagerberg JW, Graaff R, Rakhorst G, Van Oeveren W (noviembre de 2010). "Los efectos de la criopreservación en las propiedades reológicas de los glóbulos rojos". Transfusión . 50 (11): 2393–401. doi :10.1111/j.1537-2995.2010.02730.x. PMID  20561300. S2CID  22548108.
10. Southard JH (junio de 1989). "Ensayos de viabilidad en la preservación de órganos". Criobiología . 26 (3): 232–8. doi :10.1016/0011-2240(89)90017-5. PMID  2663353.
11. Davey HM (agosto de 2011). "Vida, muerte y lo intermedio: significados y métodos en microbiología". Microbiología aplicada y ambiental . 77 (16): 5571–6. Bibcode :2011ApEnM..77.5571D. doi :10.1128/AEM.00744-11. PMC 3165249 . PMID  21705550. 
12. Crutchfield A, Diller K, Brand J (1 de febrero de 1999). "Crioconservación de Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyta)". Revista Europea de Ficología . 34 (1): 43–52. Código Bibliográfico :1999EJPhy..34...43C. doi :10.1080/09670269910001736072.
13. Wusteman MC, Pegg DE, Robinson MP, Wang LH, Fitch P (febrero de 2002). "Medios de vitrificación: toxicidad, permeabilidad y propiedades dieléctricas". Criobiología . 44 (1): 24–37. doi :10.1016/S0011-2240(02)00002-0. PMID  12061845.

Lectura adicional

• Stoddart MJ (2011). Viabilidad de células de mamíferos: métodos y protocolos . Métodos en biología molecular. Vol. 740. Nueva York, NY: Springer. doi :10.1007/978-1-61779-108-6. ISBN 978-1-61779-107-9. Número de identificación del sujeto  3704247.
• Riss TL, Moravec RA, Niles AL, Duellman S, Benink HA, Worzella TJ, et al. (2004). "Ensayos de viabilidad celular". En Sittampalam GS, Grossman A, Brimacombe K, et al. (eds.). Manual de orientación de ensayos . Bethesda (MD): Eli Lilly & Company y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales. PMID  23805433.