La electroforesis capilar ( EC ) es una familia de métodos de separación electrocinética realizados en capilares de diámetro submilimétrico y en canales micro y nanofluídicos. Muy a menudo, la EC se refiere a la electroforesis capilar en zona ( CZE ), pero otras técnicas electroforéticas, incluida la electroforesis capilar en gel (CGE), el enfoque isoeléctrico capilar (CIEF), la isotacoforesis capilar y la cromatografía electrocinética micelar (MEKC), también pertenecen a esta clase de métodos. [1] En los métodos de EC, los analitos migran a través de soluciones electrolíticas bajo la influencia de un campo eléctrico . Los analitos se pueden separar de acuerdo con la movilidad iónica y/o la partición en una fase alterna a través de interacciones no covalentes . Además, los analitos se pueden concentrar o "enfocar" por medio de gradientes de conductividad y pH .
La instrumentación necesaria para realizar la electroforesis capilar es relativamente sencilla. En la figura 1 se muestra un esquema básico de un sistema de electroforesis capilar . Los componentes principales del sistema son un vial de muestra, viales de origen y destino, un capilar, electrodos , una fuente de alimentación de alto voltaje , un detector y un dispositivo de salida y manejo de datos. El vial de origen, el vial de destino y el capilar se llenan con un electrolito, como una solución tampón acuosa. Para introducir la muestra, la entrada del capilar se coloca en un vial que contiene la muestra. La muestra se introduce en el capilar mediante acción capilar , presión, sifón o electrocinéticamente, y luego el capilar se devuelve al vial de origen. La migración de los analitos se inicia mediante un campo eléctrico que se aplica entre los viales de origen y destino y se suministra a los electrodos mediante la fuente de alimentación de alto voltaje. En el modo más común de CE, todos los iones, positivos o negativos, son arrastrados a través del capilar en la misma dirección mediante flujo electroosmótico . Los analitos se separan a medida que migran debido a su movilidad electroforética y se detectan cerca del extremo de salida del capilar. La salida del detector se envía a un dispositivo de salida y manejo de datos, como un integrador o una computadora . Luego, los datos se muestran como un electroferograma, que informa la respuesta del detector en función del tiempo . Los compuestos químicos separados aparecen como picos con diferentes tiempos de migración en un electroferograma. [2] La técnica a menudo se atribuye a James W. Jorgensen y Krynn DeArman Lukacs, quienes demostraron por primera vez las capacidades de esta técnica. [3] La electroforesis capilar se combinó por primera vez con la espectrometría de masas por Richard D. Smith y colaboradores, y proporciona una sensibilidad extremadamente alta para el análisis de tamaños de muestra muy pequeños. A pesar de los tamaños de muestra muy pequeños (normalmente solo se introducen unos pocos nanolitros de líquido en el capilar), se logra una alta sensibilidad y picos agudos en parte debido a las estrategias de inyección que dan como resultado una concentración de analitos en una zona estrecha cerca de la entrada del capilar. Esto se logra en inyecciones a presión o electrocinéticas simplemente suspendiendo la muestra en un tampón de menor conductividad ( por ejemplo, menor concentración de sal) que el tampón de ejecución. Un proceso llamado apilamiento de muestras amplificado en campo (una forma de isotacoforesis ) da como resultado la concentración del analito en una zona estrecha en el límite entre la muestra de baja conductividad y el tampón de ejecución de mayor conductividad.
Para lograr un mayor rendimiento de las muestras, se utilizan instrumentos con conjuntos de capilares para analizar muchas muestras simultáneamente. Estos instrumentos de electroforesis con conjuntos de capilares (CAE) con 16 o 96 capilares se utilizan para la secuenciación de ADN capilar de rendimiento medio a alto, y los extremos de entrada de los capilares están dispuestos espacialmente para aceptar muestras directamente de placas de 96 pocillos con un tamaño estándar de SBS. Ciertos aspectos de la instrumentación (como la detección) son necesariamente más complejos que para un sistema de un solo capilar, pero los principios fundamentales de diseño y funcionamiento son similares a los que se muestran en la Figura 1.
La separación por electroforesis capilar puede detectarse mediante varios dispositivos de detección. La mayoría de los sistemas comerciales utilizan la absorbancia UV o UV-Vis como su modo principal de detección. En estos sistemas, una sección del propio capilar se utiliza como celda de detección. El uso de la detección en tubo permite la detección de analitos separados sin pérdida de resolución. En general, los capilares utilizados en la electroforesis capilar están recubiertos con un polímero (frecuentemente poliimida o teflón ) para aumentar la flexibilidad. Sin embargo, la parte del capilar utilizada para la detección UV debe ser ópticamente transparente. Para los capilares recubiertos de poliimida, un segmento del recubrimiento normalmente se quema o se raspa para proporcionar una ventana desnuda de varios milímetros de largo. Esta sección desnuda del capilar puede romperse fácilmente, y hay capilares disponibles con recubrimientos transparentes para aumentar la estabilidad de la ventana de la celda. La longitud del recorrido de la celda de detección en la electroforesis capilar (~ 50 micrómetros ) es mucho menor que la de una celda UV tradicional (~ 1 cm ). Según la ley de Beer-Lambert , la sensibilidad del detector es proporcional a la longitud del recorrido de la celda. Para mejorar la sensibilidad, se puede aumentar la longitud del recorrido, aunque esto da como resultado una pérdida de resolución. El propio tubo capilar se puede expandir en el punto de detección, creando una "celda de burbuja" con una longitud de recorrido más larga o se pueden agregar tubos adicionales en el punto de detección como se muestra en la figura 2. Sin embargo, ambos métodos disminuirán la resolución de la separación. [4] Esta disminución es casi imperceptible si se produce un aneurisma liso en la pared de un capilar mediante calentamiento y presurización, ya que se puede preservar el flujo de tapón . Esta invención de Gary Gordon , patente estadounidense 5061361, generalmente triplica la longitud del recorrido de absorbancia. Cuando se usa con un detector de absorbancia UV, la sección transversal más amplia del analito en la celda permite un haz de iluminación dos veces más grande, lo que reduce el ruido de disparo en un factor de dos. En conjunto, estos dos factores aumentan la sensibilidad del detector CE de celda de burbuja de Agilent Technologies seis veces más que la de uno que utiliza un capilar recto. Esta celda y su fabricación se describen en la página 62 del número de junio de 1995 del Hewlett-Packard Journal .
La detección de fluorescencia también se puede utilizar en electroforesis capilar para muestras que fluorescen de forma natural o que están modificadas químicamente para contener etiquetas fluorescentes . Este modo de detección ofrece una alta sensibilidad y una selectividad mejorada para estas muestras, pero no se puede utilizar para muestras que no fluorescen. Se utilizan numerosas estrategias de etiquetado para crear derivados fluorescentes o conjugados de moléculas no fluorescentes, incluidas las proteínas y el ADN. La configuración para la detección de fluorescencia en un sistema de electroforesis capilar puede ser complicada. El método requiere que el haz de luz se enfoque en el capilar, lo que puede ser difícil para muchas fuentes de luz. [4] La fluorescencia inducida por láser se ha utilizado en sistemas de CE con límites de detección tan bajos como 10 −18 a 10 −21 mol. La sensibilidad de la técnica se atribuye a la alta intensidad de la luz incidente y la capacidad de enfocar con precisión la luz en el capilar. [2] La detección de fluorescencia multicolor se puede lograr mediante la inclusión de múltiples espejos dicroicos y filtros de paso de banda para separar la emisión de fluorescencia entre múltiples detectores ( por ejemplo, tubos fotomultiplicadores ), o mediante el uso de un prisma o rejilla para proyectar la emisión de fluorescencia resuelta espectralmente sobre un detector sensible a la posición, como una matriz CCD . Los sistemas CE con sistemas de detección LIF de 4 y 5 colores se utilizan de forma rutinaria para aplicaciones de secuenciación capilar de ADN y genotipado (" huella de ADN "). [5] [6]
Para obtener la identidad de los componentes de la muestra, la electroforesis capilar se puede acoplar directamente con espectrómetros de masas o espectroscopia Raman de superficie mejorada (SERS). En la mayoría de los sistemas, la salida capilar se introduce en una fuente de iones que utiliza ionización por electrospray (ESI). Los iones resultantes se analizan luego mediante el espectrómetro de masas. Esta configuración requiere soluciones tampón volátiles , lo que afectará el rango de modos de separación que se pueden emplear y el grado de resolución que se puede lograr. [4] La medición y el análisis se realizan principalmente con un equipo especializado.
En el caso de la electroforesis capilar con CE-SERS, los eluyentes pueden depositarse sobre un sustrato activo con SERS. Los tiempos de retención de los analitos pueden traducirse en distancia espacial moviendo el sustrato activo con SERS a una velocidad constante durante la electroforesis capilar. Esto permite aplicar la técnica espectroscópica posterior a eluyentes específicos para su identificación con alta sensibilidad. Se pueden elegir sustratos activos con SERS que no interfieran con el espectro de los analitos. [7]
La separación de compuestos mediante electroforesis capilar depende de la migración diferencial de los analitos en un campo eléctrico aplicado. La velocidad de migración electroforética ( ) de un analito hacia el electrodo de carga opuesta es:
La movilidad electroforética se puede determinar experimentalmente a partir del tiempo de migración y la intensidad del campo:
donde es la distancia desde la entrada hasta el punto de detección, es el tiempo requerido para que el analito alcance el punto de detección (tiempo de migración), es el voltaje aplicado (intensidad de campo) y es la longitud total del capilar. [4] Dado que solo los iones cargados se ven afectados por el campo eléctrico, los analitos neutros se separan mal mediante electroforesis capilar.
La velocidad de migración de un analito en la electroforesis capilar también dependerá de la tasa de flujo electroosmótico (EOF) de la solución tampón. En un sistema típico, el flujo electroosmótico se dirige hacia el cátodo cargado negativamente de modo que el tampón fluye a través del capilar desde el vial de origen hasta el vial de destino. Separados por diferentes movilidades electroforéticas, los analitos migran hacia el electrodo de carga opuesta. [2] Como resultado, los analitos cargados negativamente son atraídos hacia el ánodo cargado positivamente , en contra del EOF, mientras que los analitos cargados positivamente son atraídos hacia el cátodo , de acuerdo con el EOF como se muestra en la figura 3 .
La velocidad del flujo electroosmótico se puede escribir como:
donde es la movilidad electroosmótica, la cual se define como:
donde es el potencial zeta de la pared capilar y es la permitividad relativa de la solución tampón. Experimentalmente, la movilidad electroosmótica se puede determinar midiendo el tiempo de retención de un analito neutro. [4] La velocidad ( ) de un analito en un campo eléctrico se puede definir como:
Dado que el flujo electroosmótico de la solución tampón es generalmente mayor que la movilidad electroforética de los analitos, todos los analitos son transportados junto con la solución tampón hacia el cátodo. Incluso los aniones pequeños, triplemente cargados pueden ser redirigidos al cátodo por el EOF relativamente potente de la solución tampón. Los analitos con carga negativa se retienen durante más tiempo en el capilar debido a sus movilidades electroforéticas conflictivas. [2] El orden de migración observado por el detector se muestra en la figura 3 : los cationes pequeños con carga múltiple migran rápidamente y los aniones pequeños con carga múltiple se retienen con fuerza. [4]
El flujo electroosmótico se observa cuando se aplica un campo eléctrico a una solución en un capilar que tiene cargas fijas en su pared interior. La carga se acumula en la superficie interior de un capilar cuando se coloca una solución tampón dentro del capilar. En un capilar de sílice fundida , los grupos silanol (Si-OH) unidos a la pared interior del capilar se ionizan a grupos silanoato (Si-O − ) cargados negativamente a valores de pH superiores a tres. La ionización de la pared capilar se puede mejorar haciendo pasar primero una solución básica, como NaOH o KOH , a través del capilar antes de introducir la solución tampón. Atraídos por los grupos silanoato cargados negativamente, los cationes cargados positivamente de la solución tampón formarán dos capas internas de cationes (llamadas capa doble difusa o capa doble eléctrica) en la pared capilar como se muestra en la figura 4. La primera capa se conoce como capa fija porque está unida firmemente a los grupos silanoato. La capa exterior, llamada capa móvil, está más alejada de los grupos silanoato. La capa de cationes móviles se tira en la dirección del cátodo cargado negativamente cuando se aplica un campo eléctrico. Dado que estos cationes están solvatados , la solución tampón a granel migra con la capa móvil, lo que provoca el flujo electroosmótico de la solución tampón. Otros capilares, incluidos los capilares de teflón, también presentan flujo electroosmótico. El EOF de estos capilares es probablemente el resultado de la adsorción de los iones cargados eléctricamente del tampón sobre las paredes capilares. [2] La tasa de EOF depende de la intensidad del campo y de la densidad de carga de la pared capilar. La densidad de carga de la pared es proporcional al pH de la solución tampón. El flujo electroosmótico aumentará con el pH hasta que todos los silanoles disponibles que recubren la pared del capilar estén completamente ionizados. [4]
En ciertas situaciones en las que no es deseable un flujo electroosmótico fuerte hacia el cátodo, la superficie interna del capilar se puede recubrir con polímeros, surfactantes o moléculas pequeñas para reducir la electroósmosis a niveles muy bajos, restaurando la dirección normal de migración (aniones hacia el ánodo, cationes hacia el cátodo). La instrumentación CE normalmente incluye fuentes de alimentación con polaridad reversible, lo que permite utilizar el mismo instrumento en modo "normal" (con EOF y detección cerca del extremo catódico del capilar) y en modo "inverso" (con EOF suprimido o invertido, y detección cerca del extremo anódico del capilar). Uno de los enfoques más comunes para suprimir el EOF, informado por Stellan Hjertén en 1985, es crear una capa unida covalentemente de poliacrilamida lineal . [8] La superficie de sílice del capilar se modifica primero con un reactivo de silano que lleva un grupo vinilo polimerizable ( por ejemplo, 3-metacriloxipropiltrimetoxisilano), seguido de la introducción de un monómero de acrilamida y un iniciador de radicales libres . La acrilamida se polimeriza in situ , formando largas cadenas lineales, algunas de las cuales están unidas covalentemente al reactivo de silano unido a la pared. Existen numerosas otras estrategias para la modificación covalente de las superficies capilares. Los recubrimientos dinámicos o adsorbidos (que pueden incluir polímeros o moléculas pequeñas) también son comunes. [9] Por ejemplo, en la secuenciación capilar de ADN, el polímero tamizador (normalmente polidimetilacrilamida) suprime el flujo electroosmótico a niveles muy bajos. [10] Además de modular el flujo electroosmótico, los recubrimientos de la pared capilar también pueden servir para reducir las interacciones entre los analitos "pegajosos" (como las proteínas) y la pared capilar. Estas interacciones pared-analito, si son graves, se manifiestan como una eficiencia de pico reducida, picos asimétricos (de cola) o incluso una pérdida completa del analito en la pared capilar.
El número de platos teóricos, o eficiencia de separación, en la electroforesis capilar viene dada por:
donde es el número de platos teóricos , es la movilidad aparente en el medio de separación y es el coeficiente de difusión del analito. Según esta ecuación, la eficiencia de la separación solo está limitada por la difusión y es proporcional a la intensidad del campo eléctrico, aunque consideraciones prácticas limitan la intensidad del campo eléctrico a varios cientos de voltios por centímetro. La aplicación de potenciales muy altos (>20-30 kV) puede provocar la formación de arcos o la rotura del capilar. Además, la aplicación de campos eléctricos fuertes provoca un calentamiento resistivo (calentamiento Joule) del tampón en el capilar. A intensidades de campo suficientemente altas, este calentamiento es lo suficientemente fuerte como para que se puedan desarrollar gradientes de temperatura radiales dentro del capilar. Dado que la movilidad electroforética de los iones generalmente depende de la temperatura (debido tanto a la ionización dependiente de la temperatura como a los efectos de la viscosidad del disolvente), un perfil de temperatura no uniforme da como resultado una variación de la movilidad electroforética a través del capilar y una pérdida de resolución. El inicio de un calentamiento Joule significativo se puede determinar construyendo un "gráfico de la Ley de Ohm", en el que la corriente a través del capilar se mide como una función del potencial aplicado. En campos bajos, la corriente es proporcional al potencial aplicado ( Ley de Ohm ), mientras que en campos más altos la corriente se desvía de la línea recta a medida que el calentamiento da como resultado una menor resistencia del tampón. La mejor resolución se obtiene típicamente en la intensidad de campo máxima para la cual el calentamiento Joule es insignificante ( es decir, cerca del límite entre los regímenes lineal y no lineal del gráfico de la Ley de Ohm). Generalmente, los capilares de diámetro interno más pequeño admiten el uso de intensidades de campo más altas, debido a una mejor disipación de calor y gradientes térmicos más pequeños en relación con los capilares más grandes, pero con los inconvenientes de una menor sensibilidad en la detección de absorbancia debido a una longitud de trayectoria más corta y una mayor dificultad para introducir el tampón y la muestra en el capilar (los capilares pequeños requieren mayor presión y/o tiempos más largos para forzar los fluidos a través del capilar).
La eficiencia de las separaciones por electroforesis capilar es típicamente mucho mayor que la eficiencia de otras técnicas de separación como la HPLC . A diferencia de la HPLC, en la electroforesis capilar no hay transferencia de masa entre fases. [4] Además, el perfil de flujo en sistemas impulsados por EOF es plano, en lugar del perfil de flujo laminar redondeado característico del flujo impulsado por presión en columnas de cromatografía como se muestra en la figura 5. Como resultado, la EOF no contribuye significativamente al ensanchamiento de banda como en la cromatografía impulsada por presión. Las separaciones por electroforesis capilar pueden tener varios cientos de miles de platos teóricos. [11]
La resolución ( ) de las separaciones por electroforesis capilar se puede escribir como:
Según esta ecuación, la resolución máxima se alcanza cuando las movilidades electroforética y electroosmótica son similares en magnitud y opuestas en signo. Además, se puede observar que una resolución alta requiere una velocidad menor y, en consecuencia, un mayor tiempo de análisis. [4]
Además de la difusión y el calentamiento Joule (discutidos anteriormente), los factores que pueden disminuir la resolución en la electroforesis capilar de los límites teóricos en la ecuación anterior incluyen, pero no se limitan a, los anchos finitos del tapón de inyección y la ventana de detección; interacciones entre el analito y la pared capilar; no idealidades instrumentales como una ligera diferencia en la altura de los depósitos de fluido que conduce al sifonamiento; irregularidades en el campo eléctrico debido, por ejemplo, a extremos capilares cortados imperfectamente; agotamiento de la capacidad de amortiguación en los depósitos; y electrodispersión (cuando un analito tiene mayor conductividad que el electrolito de fondo). [12] Identificar y minimizar las numerosas fuentes de ensanchamiento de banda es clave para el desarrollo exitoso de un método en la electroforesis capilar, con el objetivo de acercarse lo más posible al ideal de resolución limitada por difusión.
La electroforesis capilar se puede utilizar para la determinación simultánea de los iones NH 4 + , , Na + , K + , Mg 2+ y Ca 2+ en la saliva . [13]
Una de las principales aplicaciones de la electroforesis en cadena en la ciencia forense es el desarrollo de métodos de amplificación y detección de fragmentos de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado lugar a rápidos y espectaculares avances en el análisis forense del ADN. Las separaciones de ADN se llevan a cabo utilizando capilares de sílice fundida de 50 mm de diámetro, rellenos con un tampón de tamizado. Estos capilares tienen una excelente capacidad para disipar el calor, lo que permite utilizar intensidades de campo eléctrico mucho mayores que la electroforesis en gel en placa. Por lo tanto, las separaciones en capilares son rápidas y eficientes. Además, los capilares se pueden rellenar y cambiar fácilmente para realizar inyecciones eficientes y automatizadas. La detección se produce mediante fluorescencia a través de una ventana grabada en el capilar. Hay disponibles instrumentos con un solo capilar y con matriz capilar con sistemas de matriz capaces de procesar 16 o más muestras simultáneamente para aumentar el rendimiento. [14]
Un uso importante de la CE por parte de los biólogos forenses es la tipificación de STR de muestras biológicas para generar un perfil a partir de marcadores genéticos altamente polimórficos que difieren entre individuos. Otros usos emergentes de la CE incluyen la detección de fragmentos específicos de ARNm para ayudar a identificar el origen del fluido biológico o del tejido de una muestra forense. [15]
Otra aplicación de la CE en la ciencia forense es el análisis de tintas, donde el análisis de las tintas de impresión por inyección de tinta se está volviendo más necesario debido a la falsificación cada vez más frecuente de documentos impresos con impresoras de inyección de tinta. La composición química de las tintas proporciona información muy importante en casos de documentos fraudulentos y billetes falsos. La cromatografía capilar electroforética micelar (MECC) se ha desarrollado y aplicado al análisis de tintas extraídas del papel. Debido a su alto poder de resolución en relación con las tintas que contienen varias sustancias químicamente similares, también se pueden distinguir diferencias entre tintas del mismo fabricante. Esto lo hace adecuado para evaluar el origen de los documentos en función de la composición química de las tintas. Vale la pena señalar que debido a la posible compatibilidad del mismo cartucho con diferentes modelos de impresora, la diferenciación de tintas en función de sus perfiles electroforéticos MECC es un método más confiable para la determinación del cartucho de tinta de origen (su productor y número de cartucho) en lugar del modelo de impresora de origen. [16]
Un tipo especializado de CE, la electroforesis capilar de afinidad (ACE), utiliza interacciones de unión intermolecular para comprender las interacciones proteína-ligando. [17] Las compañías farmacéuticas utilizan ACE por una multitud de razones, siendo una de las principales las constantes de asociación/unión para fármacos y ligandos o fármacos y ciertos sistemas de vehículos como micelas . Es una técnica ampliamente utilizada debido a su simplicidad, resultados rápidos y bajo uso de analitos. [18] El uso de ACE puede proporcionar detalles específicos en la unión, separación y detección de analitos y se ha demostrado que es muy práctico para estudios en ciencias de la vida. La electroforesis capilar de afinidad basada en aptámeros se utiliza para el análisis y modificaciones de reactivos de afinidad específicos. Los aptámeros modificados exhiben idealmente una alta afinidad de unión, especificidad y resistencia a las nucleasas. [19] Ren et al. incorporaron nucleótidos modificados en aptámeros para introducir nuevas características de confrontación e interacciones de alta afinidad a partir de las interacciones hidrofóbicas y polares entre IL-1α y el aptámero. [20] Huang et al. utilizan ACE para investigar las interacciones proteína-proteína utilizando aptámeros. Un aptámero de unión a α-trombina se marcó con 6-carboxifluoresceína para su uso como sonda fluorescente selectiva y se estudió para dilucidar información sobre los sitios de unión para las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN. [21]
La electroforesis capilar (EC) se ha convertido en un método importante y rentable para realizar la secuenciación de ADN que proporciona información de secuenciación de alto rendimiento y alta precisión. Woolley y Mathies utilizaron un chip de EC para secuenciar fragmentos de ADN con una precisión del 97 % y una velocidad de 150 bases en 540 segundos. [22] Utilizaron un formato de detección y etiquetado de 4 colores para recopilar datos fluorescentes. La fluorescencia se utiliza para ver las concentraciones de cada parte de la secuencia de ácido nucleico, A, T, C y G, y estos picos de concentración que se grafican a partir de la detección se utilizan para determinar la secuencia del ADN. [22]
