Un ensayo clonogénico es una técnica de biología celular para estudiar la eficacia de agentes específicos en la supervivencia y proliferación de células. Se utiliza con frecuencia en los laboratorios de investigación del cáncer para determinar el efecto de los fármacos o la radiación en las células tumorales proliferantes [1], así como para la titulación de partículas asesinas de células (CKP) en las reservas de virus. [2] Fue desarrollado por primera vez por TT Puck y Philip I. Marcus en la Universidad de Colorado en 1955. [3]
Aunque esta técnica puede proporcionar resultados precisos, el ensayo requiere mucho tiempo para su preparación y análisis y solo puede proporcionar datos sobre células tumorales que pueden crecer en cultivo. La palabra "clonogénico" se refiere al hecho de que estas células son clones unas de otras.
El experimento consta de tres pasos principales:
Al finalizar el experimento, se mide el porcentaje de células que sobrevivieron al tratamiento. Una representación gráfica de la supervivencia en función de la concentración del fármaco o la dosis de radiación ionizante se denomina curva de supervivencia celular . [4]
Para los ensayos de partículas que matan células, la fracción sobreviviente de células se utiliza para aproximar la distribución de Poisson de las partículas de virus entre las células y, por lo tanto, determinar la cantidad de CKP que encuentra cada célula.
En un experimento se puede utilizar cualquier tipo de célula , pero como el objetivo de estos experimentos en la investigación oncológica es el descubrimiento de tratamientos más eficaces contra el cáncer, las células tumorales humanas son una opción típica. Las células proceden de "líneas celulares" preparadas, que han sido bien estudiadas y cuyas características generales son conocidas, o de una biopsia de un tumor en un paciente. [5] Las células se colocan en placas de Petri o en placas que contienen varios "pocillos" circulares. Se colocan en placas un número determinado de células según el experimento; para un experimento que implica irradiación, es habitual colocar en placas un número mayor de células con una dosis de radiación creciente. Por ejemplo, con una dosis de 0 o 1 gray de radiación, se pueden colocar en placas 500 células, pero con 4 o 5 gray, se pueden colocar en placas 2500, ya que con este nivel de radiación se matan cantidades muy grandes de células y los efectos del tratamiento específico serían inobservables.
El recuento de colonias de células se realiza generalmente bajo un microscopio y es bastante tedioso. Recientemente, se han desarrollado máquinas que utilizan algoritmos para analizar imágenes. [6] Estas se capturan mediante un escáner de imágenes o un microscopio automático que puede automatizar por completo el proceso de recuento. [7] Una de estas máquinas automatizadas funciona aceptando ciertos tipos de placas de células a través de una ranura (similar a un reproductor de CD), tomando una fotografía y cargándola a una computadora para su análisis inmediato. Se obtienen recuentos confiables en segundos.
El tratamiento suele consistir en un fármaco , radiación ionizante o una combinación de ambos. [8] Algunas investigaciones actuales estudian la potenciación de los efectos de los fármacos mediante la irradiación simultánea (un efecto sinérgico ) y en esta situación se estudian dos grupos: un grupo de control, que no se trata con el fármaco; y un grupo de tratamiento, que se trata con el fármaco. Ambos grupos se irradian. Si las pendientes de sus curvas de supervivencia difieren significativamente, puede ser evidente un efecto potenciador y podría estudiarse más a fondo. Dado que muchas células tumorales no forman colonias en cultivo, el ensayo de proliferación celular, que tiene una precisión satisfactoria al parecer para medir los efectos sinérgicos entre la radiación ionizante y los fármacos, puede utilizarse como sustituto [9].
Una discusión exhaustiva de la prometedora investigación que se está realizando con la ayuda de esta técnica queda fuera del alcance de este texto, pero algunos estudios involucran el efecto de la expresión de genes o receptores particulares en la célula, las respuestas de diferentes tipos de células o los efectos sinérgicos de múltiples fármacos.