stringtranslate.com

Punto ELIS

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ( ELISpot ) es un tipo de ensayo que se centra en medir cuantitativamente la frecuencia de secreción de citocinas de una sola célula. El ensayo ELISpot también es una forma de inmunotinción , ya que se clasifica como una técnica que utiliza anticuerpos para detectar un analito proteico, y la palabra analito se refiere a cualquier sustancia biológica o química que se identifique o mida.

El ensayo FluoroSpot es una variante del ensayo ELISpot. El ensayo FluoroSpot utiliza fluorescencia para analizar múltiples analitos, lo que significa que puede detectar la secreción de más de un tipo de proteína.

Historia

Cecil Czerkinsky describió por primera vez el método ELISpot en 1983 como una nueva forma de cuantificar la producción de una inmunoglobulina específica de antígeno por parte de las células de hibridoma . En 1988, Czerkinsky desarrolló un ensayo de puntos ELISA que cuantificaba la secreción de una linfocina por parte de las células T. Ese mismo año, el método ELISpot de dos colores se combinó por primera vez con imágenes por computadora, lo que permitió la enumeración y el análisis de puntos. 1988 también marcó el primer uso de placas con fondo de membrana para realizar estos ensayos. [1]

Mecanismo de ELISpot

  1. Recubrimiento de anticuerpos : a lo largo de la técnica de ensayo ELISpot, se añaden y se eliminan diferentes sustancias de los pocillos. Los pocillos se encuentran en una placa de laboratorio con platos o cuencos diminutos que se pueden llenar con una sustancia para examinar; la cantidad de pocillos en una placa varía, pero generalmente oscila entre 16 y 100. La primera sustancia que se añade a los pocillos son anticuerpos monoclonales específicos de citocinas. Estos anticuerpos recubren las paredes de los pocillos para su futura unión a las citocinas. Los anticuerpos monoclonales significan que el anticuerpo se produce a partir de un solo linaje celular y solo puede unirse a un epítopo de proteína . Los anticuerpos policlonales , por otro lado, son capaces de unirse a múltiples epítopos de la misma proteína.
  2. Incubación celular : Las células deseadas que se observan y analizan se agregan a los pocillos. Cada pocillo puede tener la presencia o ausencia de estímulos que activan la secreción de citocinas en las células. Durante la incubación celular, se permite que las células reaccionen a cualquier estímulo presente y secreten citocinas. Hay muchos procedimientos y métodos a seguir para garantizar una manipulación adecuada de las células. Para asegurarse de que las células sean de alta calidad, las células en las muestras de sangre deben agitarse ligeramente si se almacenan durante más de 3 horas, las muestras de sangre deben diluirse en PBS ( solución salina tamponada con fosfato ) antes de almacenarse y las muestras de sangre no deben tener granulocitos . Cualquier célula que haya sido criopreservada y descongelada debe dejarse reposar durante una hora o más a 37 grados Celsius (la temperatura típica del cuerpo humano). [2] También hay muchas cosas que deben tenerse en cuenta al incubar las células, como asegurarse de que las células no experimenten movimientos bruscos que puedan afectar la formación de manchas, o que la humedad de la incubadora sea lo suficientemente alta para evitar la evaporación excesiva y el secado de los pocillos. [3]
  3. Captura de citocinas : dado que las células están rodeadas de anticuerpos monoclonales específicos de citocinas que recubren las paredes de los pocillos, las citocinas secretadas por las células incubadas comenzarán a unirse a los anticuerpos en un epítopo específico.
  4. Anticuerpos de detección : En este punto, los pocillos deben enjuagarse para eliminar las células y cualquier otra sustancia indeseable. Todo lo que debe quedar son los anticuerpos monoclonales específicos de citocinas y cualquier citocina que se haya unido a los anticuerpos. Luego, se agregan al pocillo los anticuerpos de detección específicos de citocinas biotinilados . Estos anticuerpos de detección específicos de citocinas se unirán a cualquier citocina que quede en el pocillo, ya que la citocina todavía está unida al primer conjunto de anticuerpos utilizados. Dado que la citocina se unió al primer conjunto de anticuerpos que recubren los pocillos, la citocina no se eliminó cuando se enjuagaron los pocillos.
  5. Conjugado de estreptavidina y enzima : el conjugado de estreptavidina y enzima se añade a los pocillos para que se una a los anticuerpos de detección. El objetivo de biotinilar los anticuerpos de detección específicos de citocinas añadidos a los pocillos en el paso anterior es que el anticuerpo pueda unirse al nuevo conjugado de estreptavidina y enzima. La biotinilación crea básicamente una fuerte afinidad entre la biotina del anticuerpo específico de citocinas y la estreptavidina del conjugado. [4]
  6. Adición de sustrato : Se añade un sustrato a los pocillos, y es catalizado por el conjugado enzimático añadido en el paso anterior. Esta reacción forma un precipitado insoluble que forma manchas en los pocillos. El sustrato que utilice en este paso dependerá del tipo de enzima utilizada en el paso anterior. Si se utiliza estreptavidina-ALP (conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina), entonces el uso de BCIP/NBT-plus (una mezcla de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo y cloruro de tetrazolio nitroazul) [5] como sustrato producirá manchas más definidas que son más fáciles de analizar. Si se utiliza estreptavidina-HRP (conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante), entonces el uso de TMB (tetrametilbencidina) [6] como sustrato producirá mejores resultados. [7]
  7. Análisis : Las manchas que se forman pueden luego leerse en un lector ELISpot automatizado o contarse bajo un microscopio de disección y usarse además para calcular la frecuencia de secreción de citocinas.

Mecanismo de FluoroSpot

El ensayo FluoroSpot es muy similar al ensayo ELISpot. La principal diferencia es que el ensayo FluoroSpot puede analizar la presencia de múltiples analitos en una placa de pocillos, mientras que el ensayo ELISpot solo puede analizar un analito a la vez. El ensayo FluoroSpot logra esto utilizando fluorescencia en lugar de una reacción enzimática para la detección. Los pasos para un ensayo FluoroSpot también son similares, con algunas diferencias. [8]

  1. Recubrimiento de anticuerpos : de manera similar al ELISpot, los anticuerpos monoclonales de captura específicos de citocinas se agregan a una placa con pocillos. Para ambos ensayos, las placas se tratan con etanol para evitar la contaminación y la recopilación de datos sesgada. Para el ensayo FluoroSpot, se adhiere una mezcla de diferentes tipos de anticuerpos de captura a los pocillos para detectar múltiples tipos de analitos. Para obtener resultados óptimos con el ensayo ELISpot y el FluoroSpot, se deben seguir las técnicas adecuadas de recubrimiento de placas. Las placas deben tratarse con etanol, lavarse y luego recubrirse con anticuerpos. Los métodos de tratamiento con etanol también varían según el tipo de placas que se utilicen. Para las placas MSIP e IPFL, debe agregar 15 microlitros de etanol al 35 % a todos los pocillos. Deje que el etanol repose en los pocillos durante un minuto y luego viértalo. Para las placas MAIPSWU, debe agregar 50 microlitros de etanol al 70 % a todos los pocillos. Deje que el etanol repose en los pocillos durante dos minutos y luego tírelo. Después de haber tratado los pocillos con etanol, debe lavar todos los pocillos con 200 microlitros de agua esterilizada. Este proceso de lavado debe repetirse un total de 5 veces. Una vez que los pocillos se hayan tratado con etanol y lavado, se pueden agregar los anticuerpos monoclonales de captura específicos de citocinas a cada pocillo. [9]
  2. Incubación de células : las células se agregan a los pocillos y se incuban en presencia o ausencia de estímulos que afectan la secreción de proteínas.
  3. Captura de citocinas : las proteínas/analitos secretados por las células incubadas se unirán a los anticuerpos de captura adheridos a los pocillos durante el primer paso.
  4. Anticuerpos de detección : De manera similar al ELISpot, una vez que se enjuagan los pocillos para eliminar las células y otras sustancias que no nos interesa identificar ni medir, se agrega un anticuerpo de detección biotinilado (este es específico para un tipo de analito que se desea cuantificar) y luego se agregan anticuerpos de detección marcados con etiqueta para el segundo y tercer tipo de analito que se están estudiando.
  5. Conjugados marcados con fluoróforos : en lugar de añadir un conjugado de estreptavidina y enzima, la detección de múltiples analitos se amplifica en el FluoroSpot con el uso de un anticuerpo anti-tag marcado con fluoróforo y un conjugado de estreptavidina y fluoróforo. También se añade una solución potenciadora de fluorescencia durante este paso para mejorar las señales que se utilizan más adelante al analizar los colores de fluorescencia en los pocillos. Esta fluorescencia es lo que hace posible que el FluoroSpot analice y compare múltiples analitos, a diferencia del ELISpot.
  6. Análisis : Dado que el FluoroSpot se basa en el uso de fluorescencia y no en una reacción enzimática, no es necesario un paso que agregue un sustrato para reaccionar con las enzimas (como se necesita para el ELISpot). El último paso para el ensayo FluoroSpot es analizar los fluoróforos bajo un lector de fluorescencia automatizado que tiene filtros separados para los diferentes fluoróforos que se analizan. Estos filtros deben seleccionarse para las longitudes de onda específicas de los fluoróforos si desea mediciones precisas. [8]

Dado que el ensayo FluoroSpot identifica y cuantifica la presencia de múltiples analitos, es posible que la absorción de un analito pueda afectar la secreción de otro analito; esto se denomina efectos de captura. [8] El efecto que un analito tiene sobre otro analito puede ser positivo o negativo (la producción del segundo analito puede aumentar o disminuir). Para contrarrestar los efectos de captura, es posible utilizar la coestimulación para evitar la disminución de la producción de un analito. [8] Esto es cuando se agrega a los pocillos un segundo anticuerpo que estimula la producción del mismo analito.

Aplicaciones de ELISpot y FluoroSpot

Los ensayos ELISpot y FluoroSpot se pueden utilizar en muchos campos de investigación: desarrollo de vacunas, [10] cáncer, [11] alergias, [12] caracterización de monocitos/macrófagos/células dendríticas, análisis de apolipoproteínas e investigación veterinaria. Con ELISpot, puede estudiar las respuestas de citocinas específicas de antígeno, células secretoras de anticuerpos específicos, [13] antígenos tumorales, [11] liberación de granzima B y perforina por células T, eficacia de vacunas, [14] mapeo de epítopos, [15] actividad de células T citotóxicas, detección de IL-4, IL-5 e IL-13, [12] respuestas de anticuerpos inducidas por vacunas, células B de memoria específicas de antígeno, [10] y mucho más.

Más específicamente, el ensayo ELISpot de células T se utiliza para caracterizar subconjuntos de células T. Esto se debe a que el ensayo puede detectar la producción de citocinas IFN-y, IL-2, TNF-alfa, IL-4, IL-5 e IL-13. Las primeras tres citocinas son producidas por células Th1, mientras que las últimas tres son producidas por células Th2. La medición de las respuestas de las células T a través de la producción de citocinas también permite estudiar la eficacia de las vacunas. [16]

Con T-cell FluoroSpot, se pueden controlar los linfocitos que se infiltran en los tumores. También se puede analizar la secreción de la citocina IFN-y y la granzima B para evaluar las respuestas de las células T citotóxicas. Ambas se utilizan para la investigación del cáncer. [17]

Con FluoroSpot de células B, también se puede observar la eficacia de la vacuna cuantificando la secreción de IgG, IgA e IgM antes y después de la vacunación. Este análisis de múltiples inmunoglobulinas es posible gracias al método de fluorescencia utilizado en FluoroSpot. [17]

Referencias

  1. ^ Ranieri, Elena; Popescu, Iulia; Gigante, Margherita (2014). "Ensayo de ELISPOT de CTL". Células T citotóxicas . Métodos en biología molecular. Vol. 1186. págs. 75–86. doi :10.1007/978-1-4939-1158-5_6. ISBN 978-1-4939-1157-8. Número de identificación personal  25149304.
  2. ^ "Células para ELISpot y FluoroSpot". MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  3. ^ "Incubación celular". MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  4. ^ "Biotinilación". ThermoFisher Scientific . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  5. ^ "Resumen de la ficha de datos de seguridad del BCIP/NBT-plus" (PDF) . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  6. ^ "Ficha técnica/protocolo TMB" (PDF) . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  7. ^ "Sustratos ELISpot". MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  8. ^ abcd "Principio del ensayo FluoroSpot". MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  9. ^ "Guía de recubrimiento de placas". MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  10. ^ ab "Desarrollo de vacunas". MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  11. ^ ab "Cáncer". MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  12. ^ ab "Alergia". MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  13. ^ Czerkinsky, CC (16 de diciembre de 1983). "Un ensayo inmunoenzimático ligado a la fase sólida (ELISPOT) para la enumeración de células secretoras de anticuerpos específicos". Journal of Immunological Methods . 65 (1–2): 109–121. doi :10.1016/0022-1759(83)90308-3. PMID  6361139.
  14. ^ Saletti, Giulietta (9 de mayo de 2013). "Ensayos inmunohistoquímicos ligados a enzimas para la medición directa ex vivo de respuestas inmunitarias humorales humanas inducidas por vacunas en sangre". Nature Protocols . 8 (6): 1073–1087. doi :10.1038/nprot.2013.058. PMID  23660756. S2CID  38317207.
  15. ^ "Ensayos ELISpot de células T". PROIMMUNE . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  16. ^ Strand, Nacka. "Encuentre 1 célula en 100.000 con ELISpot" (PDF) . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
  17. ^ ab Strand, Nacka. "Descubra más con FluoroSpot" (PDF) . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .